一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法
【专利摘要】本发明涉及一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，该方法通过无菌沙土覆盖抑制受污染的苔藓，使植物得以恢复及复壮，有利于保护无菌苔藓的大量人工扩繁，有利于原始材料的保持，实现了受感染材料可以在沙土中继续生长，并且更加强壮的生长和繁殖，从无菌沙土转移到新的培养基后，无菌苔藓明显较为强壮。这将为苔藓植物组培技术提供新的途径。
【专利说明】
一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法发明领域
[0001]本发明涉及一种苔藓组织培养材料感染真菌和霉菌后进行恢复和复壮的方法。具体涉及一种组培苔藓的培养与保存技术领域。
【背景技术】
[0002]苔藓植物广布于世界各地，是一类由水生生活转为陆地生活过渡型的植物类群，在高等植物中是仅次于被子植物的第二大类植物类群，能够在其他陆生植物难以生存的环境中生长繁衍，是环境演替的先锋物种。特别是荒漠耐干旱苔藓，能够忍受极端的高低温、干旱及强光照等恶劣的外界环境，是干旱半干旱沙漠地区别具特色的植物类群。
[0003]组织培养技术自建立以来在各个领域得到了非常广泛的应用，其利用非常少量的原材料，经过一系列无菌条件下的操作规范，在短时间内能够获得大量的无菌植株，该项技术已经在科学研究方面得到了广泛的应用。但是，在组织培养过程中，真菌和霉菌污染问题是普遍存在的问题，而且真菌和霉菌污染具有着爆发性，污染速度之快及污染面积之大等特点，一旦爆发，会导致全部培养材料报废。因此，一旦遇到组培材料被真菌和霉菌污染，应快速采取措施，以降低真菌霉菌污染造成的损伤。
[0004]银叶真藓(Bryum argenteum)隶属于真藓科真藓属，是一种极端耐干藓种(desiccat1n tolerance moss)，广布于腾格里沙漠、毛乌素沙地、科尔丨心沙地，构成生物结皮的优势种或共建种。该藓是最早研究报道的一种耐干藓类，其具有最高等级(A级)的耐干能力。银叶真藓对干旱胁迫具有快速的生理生化响应，并且在完全干燥和超低温(-70 °C)冷冻状态均可长时间保持活力并遇水而快速复原，是展开耐干机制研究的好材料。小立碗藓(Physcomitrella patens(Hedw.)B.S.G.)隶属葫芦藓科小立碗藓属，是一种干旱敏感物种(desiccat1n-sensitive moss)，仅能适应中度的脱水胁迫，其配子体可耐受90%的组织脱水(相当于-13MPa) ο小立碗藓，作为一种模式植物具有许多独特的优势:容易栽培，基因组与外源基因具有极高的同源性，生活史中配子体占优势，基因敲除后突变体容易观察，是展开植物分子生物学研究的好材料。对小立碗藓的研究主要集中在功能基因组学、发育生物学、系统进化学及植物的生理生化等方面。
[0005]耐干藓类植物的耐干机制，尤其是其干燥-复水过程中强大的细胞保护与细胞修复机制，是耐干研究领域的热点问题。为了深入开展耐干分子机制研究，大量、纯系的单克隆材料是首要的。因此，实验室首先要建立高效的组织培养体系，以获得大量纯系单克隆实验材料。小立碗藓是苔藓植物的模式种，已具有基因组信息，奠定了很好的遗传学研究基础，并且建立了完善而成熟的组织培养体系;银叶真藓是耐干藓类的代表性物种，在前期研究中，也建立了组织培养体系可获得大量纯系材料。然而在实验操作中，由于微环境、操作人员、实验药品批次等的不同，在实验室组织培养过程中，在接种和继代过程中难免造成真菌或霉菌的污染，一旦污染，亟需采取一定措施解决这一难题，从而保证材料得以可持续性繁殖与利用。
[0006]国内外有应对真菌和霉菌污染培养基报道，但其方法都较为复杂，一般对真菌和霉菌污染严重的培养物基采用不同药剂作为杀菌剂，如多菌灵、代森锰锌和甲霜灵等，这些方法虽然有明显的抑菌效果，但对组培材料也具有一定的伤害作用，特别在杀菌后期，容易造成混合性污染，从而使污染情况更为复杂，更难以控制。在实际的组织培养过程中，真菌若只存在培养基表面，则可能是封口膜破裂，封口不严或是培养箱中的病菌孢子过多所致，若是有白色雾状物，并存在于培养基内部，则表明是灭菌不彻底或是母液存放过久导致培养基污染;霉菌则是一些肉眼可见的绒毛状或絮状菌落，菌丝上的任何一个片段在适宜的条件下都能发展成为新个体，是一种在无菌苗污染过程中较难治理的一种菌。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种简单易操作的真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，该方法通过无菌沙土覆盖抑制受污染的苔藓，使植物得以恢复及复壮，有利于保护无菌苔藓的大量人工扩繁，有利于原始材料的保持，实现了受感染材料可以在沙土中继续生长，并且更加强壮的生长和繁殖，从无菌沙土转移到新的培养基后，无菌苔藓明显较为强壮。这将为苔藓植物组培技术提供新的途径。
[0008]本发明所述的一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，按下列步骤进行:
[0009]a、污染培养基的隔离:在无菌苔藓为小立碗藓或银叶真藓的培养过程中，对有真菌或霉菌污染的材料，首先进行隔离，将污染材料从培养箱中取出，以免造成对其他无菌材料的感染；
[0010]b、污染苔藓的恢复及复壮前的准备工作:对古尔班通古特沙漠采集回来的沙土进行处理，在室温下自然风干后，用500uM筛子进行过筛处理，去除肉眼可辨的石子、杂质及植物体残留后，装入2000mL玻璃烧杯中进行灭菌处理，将灭菌锅温度调至121°C灭菌处理30min，室温自然风干后无菌保存备用；
[0011]C、污染苔藓的恢复及复壮:整个工作都需要在无菌超净台中进行，将污染苔藓的培养皿缓慢打开后，均匀撒盖一层为2mm的无菌沙土，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μπι01.πΓ2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养2周后，复壮的材料从沙土中长出；
[0012]d、接种与培养:将步骤c得到复壮的无菌苔藓取茎尖，转入装有改良Knop固体培养基中，用paraf ilm封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μmo I.m—2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养3周后即得到强壮无菌的苔藓个体。
[0013]步骤d中改良Knop固体培养基100倍母液的组分为:磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁2.5g，氯化钾2.5g，硝酸钙1g，硫酸铁0.12666g，每个母液用2次水定容至10mL，封口，备用。
[0014]步骤d改良Knop固体培养基中每升培养基配置方法为:从母液磷酸二氢钾取10ml，硫酸镁10ml，氯化钾10ml，硝酸IilOml，硫酸铁10ml，加入2次水，定容至1L，用氢氧化钾固体调节pH值至6.5，最后加入3g明胶，灭菌温度121°C，时间20分钟，倒入无菌90mm培养皿中，凝固后使用。
[0015]本领域熟知，在组培苔藓无菌苗的过程中，遇到真菌霉菌污染问题，对无菌苔藓的生长繁殖是致命性的伤害。本发明提供了一种针对真菌霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的新方法，有利于保护无菌苔藓的大量人工扩繁，这将为苔藓植物组培技术提供新的途径和方法。
[0016]本发明所述的一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，该方法达到以下有益效果:
[0017]1.本发明提供了一种应对突发性真菌霉菌污染的情况下，无菌苔藓的恢复方法，有利于原始材料的保持。
[0018]2.通过本发明提供的真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，实现了受感染材料可以在沙土中继续生长，并且更加强壮的生长和繁殖，从无菌沙土转移到新的培养基后，无菌苔藓明显较为强壮。
[0019]3.本发明提供的真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，能适用于工业化规模生产。
【附图说明】
[0020]图1为本发明受霉菌感染的小立碗藓；
[0021 ]图2-3为本发明无菌沙土覆盖后恢复及复壮的小立碗藓；
[0022]图4-5为本发明受真菌感染的银叶真藓；
[0023]图6为本发明无菌沙土覆盖后恢复及复壮的银叶真藓。
【具体实施方式】
[0024]以下举实施例说明本发明，但并不限于给出的实施例。
[0025]实施例1
[0026]a、污染培养基的隔离:在无菌苔藓为小立碗藓的培养过程中，对有真菌或霉菌污染的材料，首先进行隔离，将污染材料从培养箱中取出，以免造成对其他无菌材料的感染；
[0027]b、污染苔藓的恢复及复壮前的准备工作:对古尔班通古特沙漠采集回来的沙土进行处理，在室温下(22°C)自然风干后，用500uM筛子进行过筛处理，去除肉眼可辨的石子、杂质及植物体残留后，装入2000mL玻璃烧杯中进行灭菌处理，将灭菌锅(Panasonic MLS-3781L)温度调至121°C灭菌处理30min，室温自然风干后无菌保存备用；
[0028]C、污染苔藓的恢复及复壮:整个工作都需要在无菌超净台中进行，将污染苔藓的培养皿缓慢打开后，均匀撒盖一层为2mm的无菌沙土，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μπι01.πΓ2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养2周后，复壮的材料从沙土中长出；
[0029]d、接种与培养:将步骤c得到复壮的无菌苔藓取茎尖，转入装有改良Knop固体培养基中，其中改良Knop固体培养基100倍母液的组分为:磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁2.5g，氯化钾2.5g，硝酸钙1g，硫酸铁0.12666g，每个母液用2次水定容至10mL，封口，备用，每升培养基配置方法为:从母液磷酸二氢钾取10ml，硫酸镁10ml，氯化钾10ml，硝酸钙10ml，硫酸铁1ml，加入2次水，定容至IL，用氢氧化钾固体调节pH值至6.5，最后加入3g明胶，灭菌温度121°C，时间20分钟，倒入无菌90mm培养皿中，凝固后使用，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μπι01.πΓ2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养3周后即得到强壮无菌的苔藓小立碗藓个体(图2、图3)。
[0030]实施例2
[0031]a、污染培养基的隔离:在无菌苔藓为银叶真藓的培养过程中，对有真菌或霉菌污染的材料，首先进行隔离，将污染材料从培养箱中取出，以免造成对其他无菌材料的感染；
[0032]b、污染苔藓的恢复及复壮前的准备工作:对古尔班通古特沙漠采集回来的沙土进行处理，在室温下(22°C)自然风干后，用500uM筛子进行过筛处理，去除肉眼可辨的石子、杂质及植物体残留后，装入2000mL玻璃烧杯中进行灭菌处理，将灭菌锅(Panasonic MLS-3781L)温度调至121°C灭菌处理30min，室温自然风干后无菌保存备用；
[0033]C、污染苔藓的恢复及复壮:整个工作都需要在无菌超净台中进行，将污染苔藓的培养皿缓慢打开后，均匀撒盖一层为2mm的无菌沙土，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μπι01.πΓ2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养2周后，复壮的材料从沙土中长出；
[0034]d、接种与培养:将步骤c得到复壮的无菌苔藓取茎尖，转入装有改良Knop固体培养基中，其中改良Knop固体培养基100倍母液的组分为:磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁2.5g，氯化钾
2.5g，硝酸钙1g，硫酸铁0.12666g，每个母液用2次水定容至10mL，封口，备用，每升培养基配置方法为:从母液磷酸二氢钾取10ml，硫酸镁10ml，氯化钾10ml，硝酸钙10ml，硫酸铁1ml，加入2次水，定容至IL，用氢氧化钾固体调节pH值至6.5，最后加入3g明胶，灭菌温度121°C，时间20分钟，倒入无菌90mm培养皿中，凝固后使用，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27μπι01.πΓ2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养3周后即得到强壮无菌的苔藓银叶真藓个体(图6)。
[0035]采用本发明得到的新的植株体是原始材料后代，是受污染苔藓的恢复及复壮后的材料，保证了实验中获取材料的一致性。
【主权项】
1.一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，其特征在于按下列步骤进行: a、污染培养基的隔离:在无菌苔藓为小立碗藓或银叶真藓的培养过程中，对有真菌或霉菌污染的材料，首先进行隔离，将污染材料从培养箱中取出，以免造成对其他无菌材料的感染； b、污染苔藓的恢复及复壮前的准备工作:对古尔班通古特沙漠采集回来的沙土进行处理，在室温下自然风干后，用500uM筛子进行过筛处理，去除肉眼可辨的石子、杂质及植物体残留后，装入2000mL玻璃烧杯中进行灭菌处理，将灭菌锅温度调至121°C灭菌处理30min，室温自然风干后无菌保存备用； C、污染苔藓的恢复及复壮:整个工作都需要在无菌超净台中进行，将污染苔藓的培养皿缓慢打开后，均勾撒盖一层为2mm的无菌沙土，用paraf i Im封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27 ymol.m—2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养2周后，复壮的材料从沙土中长出； d、接种与培养:将步骤c得到复壮的无菌苔藓取茎尖，转入装有改良Knop固体培养基中，用paraf iIm封口膜封口，将培养皿置于光照培养箱中，温度22°C，采用光照强度27 ymol? m—2.s—1，光照条件和黑暗条件交替进行，时间分别为12h/12h，培养3周后即得到强壮无菌的苔藓个体。2.根据权利要求1所述的一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，其特征在于步骤d中改良Knop固体培养基100倍母液的组分为:磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁2.5g，氯化钾2.5g，硝酸钙1g，硫酸铁0.12666g，每个母液用2次水定容至10mL，封口，备用。3.根据权利要求2所述的一种真菌和霉菌污染培养基苔藓的恢复及复壮的方法，其特征在于步骤d改良Knop固体培养基中每升培养基配置方法为:从母液磷酸二氢钾取10ml，硫酸镁1ml，氯化钾1ml，硝酸|丐1ml，硫酸铁1ml，加入2次水，定容至IL，用氢氧化钾固体调节pH值至6.5，最后加入3g明胶，灭菌温度1210C，时间20分钟，倒入无菌90mm培养皿中，凝固后使用。
【文档编号】A01H4/00GK106035092SQ201610567822
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】张道远, 卓露, 杨红兰, 李小双
【申请人】中国科学院新疆生态与地理研究所