草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法
【专利摘要】本发明公开了草莓花药脱毒组培苗的移栽驯化方法，包括以下步骤：1）花粉采集与清洗消毒，2）诱导分化成苗，3）幼苗快繁与生根，4）出苗与洗苗，5）移栽，6）驯化。本发明的有益效果为：本发明提供的方法，无须练苗，直接洗净培养基即可进行移栽，在苗床上搭建塑料拱棚，封闭三天后有效控制拱膜中温度、基质湿度、光照时间和强度，花粉脱毒组培苗的成活率可达100%，获得无病毒株的概率大幅提高；同时，草莓花粉脱毒率能达100%，可以不用病毒检测程序，缩短了从脱毒到规模生产种苗的周期，有效降低了生产成本与劳动成本，大幅度提高生产效益，提供了大批量的优质脱毒种苗，为草莓可持续产业化健康发展提供了技术支撑。
【专利说明】
草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及植物组培育苗技术领域，具体涉及草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法。【背景技术】
[0003]花粉植物的试管苗在培养基上主要是靠培养基中的糖分进行异养代谢，而且在试管中湿度和温度都比较稳定，一旦移入土壤，生理生态环境发生巨大变化，往往由于试管苗不能很快适应这种变化而造成大批死亡，特别是移栽适值自然气温高低变化频繁，按期移栽很难成活。目前普遍采用是瓶苗有两个阶段炼苗过程:一是组培瓶苗移到室外在自然光下放置2 d?3 d练苗;二是再开瓶盖炼苗3 d?5 d，结果是由异养换到自养环境时间短，幼苗还没有适宜，再开瓶盖，污染率迅速上升可达到30%?60%，大大降低幼苗的抵抗力，移栽后成活率大幅度下降。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，包括以下步骤:1)草莓花粉的取材与清洗消毒:采用田间草莓花粉发育至4_?6_大小的单核靠边期的花药，花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是:花萼未开放，花蕾略长于花冠或花冠刚露白、花冠白色或者淡绿且不松动、花药微黄而充实;将采取的新鲜花药放在2 °C?4°C中储藏24h后，用自来水将花药表面冲洗干净;冲洗过的花药移入超净工作台上放入无菌烧杯中，先用75%酒精消毒30 s?40s，无菌水冲洗2遍?3遍，再用0.1%的升萊溶液消毒4 min?5 min，用灭菌过的玻璃棒顺一个方向轻轻搅动，然后用无菌水冲洗4遍?5遍，每次1 min，迅速用滤纸吸干，得到无菌花药；2)花药愈伤组织的诱导及茎叶分化:在无菌条件下，用无菌针将已消毒的花蕾固定在已经过灭菌的大橡皮上；用已灭菌的解剖刀和解剖针剥开花蕾，取出花药，将取出的花药接种到装有愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基组成为:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗糖+6g/L?8g/L琼脂，pH值为5.8;当愈伤组织的直径2 mm?3 mm时，转入分化培养基中，分化培养基组成为:MS+ BA 0.08 mg/L?0.12mg/L+IBA 0.8 mg/L?1.2mg/L中+3%蔗糖+6g/L ?8g/L琼脂，pH值为5.8;当形成明显的丛生芽时将芽切成小块，接种于丛生增殖培养基上进行增殖，丛生增殖培养基组成为:MS+BA 1.2 mg/L?1.8mg/L+NAA 0.08 mg/L?0.12mg/+ 3%蔗糖+6g/L?8g/L琼脂L，pH值为5 ? 8;3)脱毒组培苗快繁及生根培养:将步骤2)得到的脱毒苗放入增殖培养基中25d?35d长成丛生瓶苗;增殖培养基为加入 6_苄氨基腺嘌呤0.19mg/L?0.21mg/L的MS培养基;将高3cm、生长健壮的无根苗接种于MS培养基上，2周后，苗基部长出辐射状的白色小根，每株生根5条?7条，3周后，根生长1 cm?1.5cm，用于移栽；4)移栽前基质准备:基质的组成为:按照重量比草炭:珍珠岩:蛭石=3:1:1;在移苗前Id，将混合好、已润湿的基质装入32、50穴的穴盘或直径9cm?12cm的营养钵中，轻压；用50%的可湿性多菌灵粉剂1000倍液浇透，第二天移苗时，基质含水量为70%?80 %，即适合移苗；5)出瓶洗苗分级:起苗前用75 %酒精棉将所用操作工具全部消毒，直接从培养室移出生根的组培瓶苗到洗涤室，用直径1 cm工具把组培苗从瓶中拣出，置于25 °C?28 °C的清水中洗净根部的培养基，不要伤到根系、嫩芽及叶片，然后按大小将幼苗分级，并分出无根苗；6)移栽:当天把洗净分级的组培苗运到种苗苗圃网室然进行移栽，用准备好的工具在穴盘的基质上插洞，将幼苗根部轻轻放入洞中，轻轻掩上，稍压实;移完后用喷雾器轻喷水，冲洗幼苗叶片上的基质，使得根系与基质接触更紧密，以利于根系生长;对于无根苗，先沾适宜浓度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0? 8mg/L?1.0mg/L的生根粉或生根剂，再移植，或移植后用浓度为800倍液的生根粉进行灌根；7)驯化:移栽完当天须在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，从侧面揭膜面积的10%，开始驯化组培苗;随后每天揭膜时间增加lOmin，揭膜面积增加10%;视环境中的温度高低和育苗基质含水量适当增加光照通风透气时间，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移植后需进行遮光管理，移植后的前2d用遮阳网遮光60%?70%，之后的10d?14d逐渐见光， 直至不遮光;驯化的组培苗成活率达100%，30d后便可移至直径为10cm的营养钵或育苗床进行培育。
[0006]进一步的，上述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，所述步骤3)脱毒组培苗快繁及生根培养之前，可以采用酶联免疫吸附法，即ELISA法进行病毒检测。
[0007]进一步的，上述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，所述步骤2)中，花药愈伤组织的诱导及茎叶分化生长条件为:温度23°C?25°C，光照强度2500 lx?30001x，光照14 h/d?16h/d，培养时间20 d?30d。
[0008]进一步的，上述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，所述步骤3)中，脱毒组培苗快繁及生根培养的生长条件为:温度23°C?25°C，光照强度2000 lx?30001x，光照10 h/ d?12h/d，快繁及生根两个阶段培养时间50 d?60d。
[0009]进一步的，上述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，所述步骤6)中，移栽条件为:温度15°C?25°C。[〇〇1〇]进一步的，上述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，所述步骤7)中，驯化条件为:温度20°C?38°C，培养时间20 d?30d。
[0011]本发明的有益效果为:本发明提供的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，采用在移栽前无须对瓶苗的练苗过程，直接从组织培养室移出生根的草莓组培瓶苗到洗涤室， 直接打开瓶盖取苗，用25°c?28°C的温水洗净根部的培养基，当天运到种苗苗圃网室然进行移栽，移栽当天在苗床上搭建塑料拱棚，封闭三天后有效控制拱膜中温度、基质湿度、光照时间和强度，花粉脱毒组培苗的成活率可达100%，采用花粉培养技术较茎尖培养和热处理脱毒获得无病毒株的概率大幅提高；同时，花粉脱毒不用病毒检测程序，缩短了从脱毒到规模生产种苗的周期，有效降低了生产成本与劳动成本，大幅度提高生产效益，提供了大批量的优质脱毒种苗，为草莓可持续产业化健康发展提供了技术支撑。【具体实施方式】
[0012]本发明所用制剂来源:多菌灵:厂家:安徽华星化工股份有限公司；农药登记证号:PD85150-19;生产许可证号:XK13-003-00126;产品标准证号:HG3290-2000;批号:2014 年 01 月 20 日；生根剂(粉):NAA的厂家:上海蓝季科技发展有限公司Chembase，批号:Lot N0.B0013K0321017; IBA的厂家:上海蓝季科技发展有限公司Chembase登记号:CAS 133-32-4批号: 141212。[0〇13] 实施例1:草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，包括以下步骤:1)草莓花粉的取材与清洗消毒:采用田间草莓花粉发育至4_?6_大小的单核靠边期的花药，花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是:花萼未开放，花蕾略长于花冠或花冠刚露白、花冠白色或者淡绿且不松动、花药微黄而充实;将采取的新鲜花药放在2 °C?4°C中储藏24h后，用自来水将花药表面冲洗干净;冲洗过的花药移入超净工作台上放入无菌烧杯中，先用75%酒精消毒30 s?40s，无菌水冲洗2遍?3遍，再用0.1%的升萊溶液消毒4 min?5 min，用灭菌过的玻璃棒顺一个方向轻轻搅动，然后用无菌水冲洗4遍?5遍，每次1 min，迅速用滤纸吸干，得到无菌花药；2)花药愈伤组织的诱导及茎叶分化:在无菌条件下，用无菌针将已消毒的花蕾固定在已经过灭菌的大橡皮上；用已灭菌的解剖刀和解剖针剥开花蕾，取出花药，将取出的花药接种到装有愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基组成为:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗糖+6g/L?8g/L琼脂，pH值为5.8;当愈伤组织的直径2mm?3mm时，转入分化培养基MS+ BA 0.08 11^几?0.1211^几+11^0.8 11^几?1.211^/1^+3%鹿糖+68几?88几琼脂中411值为5.8; 当形成明显的丛生芽时将芽切成小块，接种于丛生增殖培养基上进行增殖，丛生增殖培养基组成为MS+BA 1.2 mg/L?1.8mg/L+NAA 0.08 mg/L?0.12mg/L+3%鹿糖+6g/L?8g/L琼脂，pH值为5.8;花药愈伤组织的诱导及茎叶分化生长条件为:温度23°C?25°C，光照强度2500 lx? 30001x，光照 14 h/d?16h/d，培养时间20 d?30d;3)脱毒组培苗快繁及生根培养:此步骤之前，可采用酶联免疫吸附法，即ELISA法进行病毒检测，也可不检测；将步骤2)得到的脱毒苗放入增殖培养基中25 d?35d长成丛生瓶苗;增殖培养基为加入6-苄氨基腺嘌呤0.19mg/L?0.21mg/L的MS培养基;将高3cm、生长健壮的无根苗接种于MS 培养基上，2周后，苗基部长出辐射状的白色小根，每株生根5条?7条，3周后，根生长1 cm? 1.5cm，用于移栽；脱毒组培苗快繁及生根培养的生长条件为:温度23 °C?25 °C，光照强度2000 lx? 30001x，光照10 h/d?12h/d，快繁及生根两个阶段培养时间50 d?60d;4)移栽前基质准备:基质配方:草炭;珍珠岩:蛭石=3:1:1;在移苗前1天，将混合好、已润湿的基质装入32、50穴的穴盘或直径9cm?12cm的营养钵中，轻压；用50%的可湿性多菌灵粉剂1000倍液浇透，第二天移苗时，基质含水量为70%? 80 %，即适合移苗；5)出瓶洗苗分级:起苗前用75 %酒精棉将所用操作工具全部消毒，直接从培养室移出生根的组培瓶苗到洗涤室，用直径1 cm工具把组培苗从瓶中拣出，置于25 °C?28 °C的清水中洗净根部的培养基，不要伤到根系、嫩芽及叶片，然后按大小将幼苗分级，并分出无根苗；6)移栽:当天把洗净分级的组培苗运到种苗苗圃网室然进行移栽，用准备好的工具在穴盘的基质上插洞，将幼苗根部轻轻放入洞中，轻轻掩上，稍压实;移完后用喷雾器轻喷水，冲洗幼苗叶片上的基质，使得根系与基质接触更紧密，以利于根系生长;对于无根苗，先沾适宜浓度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0? 8mg/L?1.0mg/L的生根粉或生根剂，再移植，或移植后用浓度为800倍液的生根粉进行灌根;移栽条件为:温度15°C?25°C ;7)驯化:移栽完当天须在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，从侧面揭膜面积的10%，开始驯化组培苗;随后每天揭膜时间增加lOmin，揭膜面积增加10%;视环境中的温度高低和育苗基质含水量适当增加光照通风透气时间，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移植后需进行遮光管理，移植后的前2d用遮阳网遮光60%?70%，之后的10d?14d逐渐见光， 直至不遮光;驯化的组培苗成活率达100%，30d后便可移至直径为10cm的营养钵或育苗床进行培育；驯化条件为:温度20°C?38°C，培养时间20 d?30d。[〇〇14]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，包括以下步骤:1)草莓花粉的取材与清洗消毒:采用田间草莓花粉发育至4_?6mm大小的单核靠边期的花药，花粉单核靠边期的草莓 花蕾形态是:花萼未开放，花蕾略长于花冠或花冠刚露白、花冠白色或者淡绿且不松动、花 药微黄而充实;将采取的新鲜花药放在2 °C?4 °C中储藏24h后，用自来水将花药表面冲洗 干净；冲洗过的花药移入超净工作台上放入无菌烧杯中，先用75%酒精消毒30 s?40 s，无 菌水冲洗2遍?3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒4 min?5 min，用灭菌过的玻璃棒顺一个方 向轻轻搅动，然后用无菌水冲洗4遍?5遍，每次1分钟，迅速用滤纸吸干，得到无菌花药；2)花药愈伤组织的诱导及茎叶分化:在无菌条件下，用无菌针将已消毒的花蕾固定在已经灭菌过的大橡皮上；用已灭菌的 解剖刀和解剖针剥开花蕾，取出花药，将取出的花药接种到装有愈伤组织诱导培养基上，愈 伤组织诱导培养基组成为:MS+ BA 1.5 mg/L?2.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L?0.25mg/L+3%蔗 糖+6 g/L?8 g/L琼脂，pH值为5.8;当愈伤组织的直径2 mm?3 mm时，转入分化培养基中， 分化培养基组成为:MS+ BA 0.08 mg/L?0.12mg/L+IBA 0.8 mg/L?1.2 mg/L+3%蔗糖+6 g/L?8 g/L琼脂，pH值为5.8，当形成明显的丛生芽时将芽切成小块，接种于丛生增殖培养 基上进行增殖，丛生增殖培养基组成为:MS+BA 1.2 mg/L?1.8 mg/L+NAA 0.08 mg/L? 0 ? 12 mg/L+3%蔗糖+6 g/L?8 g/L琼脂，pH值为5 ? 8;3)脱毒组培苗快繁及生根培养:将步骤2)得到的脱毒苗放入增殖培养基中25d?35d长成丛生瓶苗;增殖培养基为加入 6_苄氨基腺嘌呤0.19 mg/L?0.21 mg/L的MS培养基;将高3cm、生长健壮的无根苗接种于MS 培养基上，2周后，苗基部长出辐射状的白色小根，每株生根5条?7条，3周后，根生长1 cm? 1.5cm，用于移栽；4)移栽前基质准备:基质的组成为:按照重量比草炭:珍珠岩:蛭石=3:1:1;在移苗前1天，将混合好、已润湿的基质装入32、50穴的穴盘或直径9?12cm的营养钵 中，轻压；用50%的可湿性多菌灵粉剂1000倍液浇透，第二天移苗时，基质含水量为70%?80 %，即适合移苗；5)出瓶洗苗分级:起苗前用75 %酒精棉将所用操作工具全部消毒，直接从培养室移出生根的组培瓶苗到 洗涤室，用直径1 cm工具把组培苗从瓶中拣出，置于25 °C?28 °C的清水中洗净根部的培养 基，不要伤到根系、嫩芽及叶片，然后按大小将幼苗分级，并分出无根苗；6)移栽:当天把洗净分级的组培苗运到种苗苗圃网室然进行移栽，用准备好的工具在穴盘的基 质上插洞，将幼苗根部轻轻放入洞中，轻轻掩上，稍压实;移完后用喷雾器轻喷水，冲洗幼苗 叶片上的基质，使得根系与基质接触更紧密，以利于根系生长;对于无根苗，先沾适宜浓度: NAA 0.05mg/L?0.1mg/L或IBA 0.8 mg/L?1.0 mg/L的生根粉或生根剂，再移植，或移植后 用浓度为800倍液的生根粉进行灌根；7)驯化:移栽完当天须在苗床上搭建塑料小拱棚，密封3d后每天早上或傍晚掀膜30min，从侧面揭膜面积的10%，开始驯化组培苗;随后每天揭膜时间增加lOmin，揭膜面积增加10%;视环境 中的温度高低和育苗基质含水量适当增加光照通风透气时间，l〇d?15 d后可揭去薄膜;移 植后需进行遮光管理，移植后的前2d用遮阳网遮光60%?70%，之后的10 d?14d逐渐见光， 直至不遮光;驯化的组培苗成活率达100%，30d后便可移至直径为10cm的营养钵或育苗床进行培育。2.根据权利要求1所述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，所述步骤 3)脱毒组培苗快繁及生根培养之前，采用酶联免疫吸附法，S卩ELISA法进行病毒检测。3.根据权利要求1所述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，花药愈伤组织的诱导及茎叶分化生长条件为:温度23°C?25°C，光照强度2500 lx? 30001x，光照 14 h/d?16h/d，培养时间20 d?30d。4.根据权利要求1所述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，脱毒组培苗快繁及生根培养的生长条件为:温度23 °C?25 °C，光照强度2000 lx? 30001x，光照10 h/d?12h/d，快繁及生根两个阶段培养时间50 d?60d。5.根据权利要求1所述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，所述步骤6)中，移栽条件为:温度15°C?25°C。6.根据权利要求1所述的草莓花粉脱毒组培苗的移栽驯化方法，其特征在于，所述步骤7)中，驯化条件为:温度20°C?38°C，培养时间20 d?30d。
【文档编号】A01H4/00GK105993962SQ201610603534
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】陈英, 张爱萍, 于盛, 张西英
【申请人】新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所