一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法，包括：亲本选择：对水稻材料进行稻瘟病抗性基因的鉴定，根据以下原则组配优势组合：亲本中至少有一个含有累计推广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘；符合抗稻瘟病多基因聚合模式“Pita+Pb1+Piz?t”，抗性基因互补；根据双亲系谱和形态差异，适度拓宽双亲遗传距离，使F1产量超亲优势在8％?15％，F1的株高和播始历期超中亲优势均小于3％；根据育种目标，进行聚合育种，获得穗瘟病抗性水稻品种；育种目标至少包括聚合“Pita+Pb1+Piz?t”和抗穗颈瘟。利用本发明方法选育的品系在产量和抗性得到较好的协调，尤其穗瘟的抗谱及持久抗性水平得到了显著提高。
【专利说明】
一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及育种，尤其涉及一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻 痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都 造成严重的粮食损失。抗病品种的选育和推广是防治稻瘟病最环保、最经济和最有效的办 法。传统的抗稻瘟病育种依赖于抗性表型鉴定，易受到环境条件和人为误差的影响，抗性基 因不明确，成功培育中抗稻瘟病概率低。随着分子标记技术的应用，抗病基因多基因聚合越 来越成为现实。
[0003] 稻瘟病分为叶瘟和穗瘟，穗瘟危害最为严重，直接影响水稻穗数、粒重及品质。到 目前为止，国内外利用分子标记技术已鉴定和定位80多个水稻稻瘟病抗性基因，克隆了叶 瘟抗性基因：Pia，Pib，Pid2, Pik, Pik-h/Pi54，Pik-m, Pik-p ,Pish ,Pit ,Pita, Piz-t, Pil, ?12，？丨5，？丨9 4丨21，？丨36，？丨37，？丨56，？丨63,?丨0)39等22个，2个穗瘟抗性基因：？丨25/?丨(13和 Pbl基因，并开发了针对？^&、？讣、？丨1^丨1〇11、？丨1^)、？丨1、？^、？丨5和？丨25等基因的功能特异 性标记（Lei et al.2013;Ma et al.2013;国家水稻数据中心：http://www.ricedata.cn/ gene/)，并在育种中应用，尤其是Pita、Pib和Pita+Pib基因组合在江苏抗稻瘟病育种改良 中加以利用。据对2015年江苏省227预试材料基因型与综合病指分析，76份含抗病基因 Pita +Pib品系达到中抗稻瘟病(综合病指低于4.0)的成功概率仅为22.37 %。
[0004] 江苏省抗稻瘟病品种比例低，大面积种植感病品种易导致稻瘟病菌群相对专一的 强致病力生理小种的出现，种群变化会影响主栽品种的抗病性。随着稻草全量(半量)还田 技术的推广，稻田微生态环境中病原菌基数加大，增加了该病害暴发的频率;2014、2015年 江苏全省稻瘟病发生面积均达1400万亩以上(江苏水稻种植面积为3400万亩）。抗稻瘟病品 种的推广应用，促进维持田间稻瘟病菌生理小种种群结构的稳定，预防强致病力优势小种 的积累，降低稻瘟病暴发的机率和强度。从生物多样性的角度出发，有必要引进新基因源到 育种计划来实现新形势下水稻生产的可持续发展。
[0005] 另据有关文献研究表明：强抗性与高产存在一定的矛盾。抗病机制的运行，是要消 耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗)品种往往与其产量有一定负相关。此外，不同基因聚合， 存在着基因互作，有正向效应和负向效应。抗病基因的多基因聚合是抗稻瘟病病育种成败 的关键。
【发明内容】
[0006] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种培育抗稻瘟病的水稻品 种的方法，利用本发明方法选育的品系在产量和抗性得到较好的协调，对穗瘟的抗谱及持 久抗性水平得到了显著提高。
[0007] 技术方案:一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法，包括：
[0008] (I)亲本选择:对水稻材料进行稻瘟病抗性基因的鉴定，在水稻材料中根据以下配 组原则组配优势组合：
[0009] 亲本中至少有一个含有累计推广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘；
[0010]符合抗稻瘟病多基因聚合模式"Pita+Pbl+Piz-t"，抗性基因互补；
[0011] 根据双亲系谱和形态差异，适度拓宽双亲遗传距离，使Fl产量超亲优势在8 %-15%，F1的株高和播始历期超中亲优势均小于3% ;
[0012] (2)根据育种目标，对亲本材料进行聚合育种，获得穗瘟病抗性水稻品种;所述的 育种目标至少包括聚合"Pita+Pbl+Piz-t"和抗穗颈痕。
[0013] 本发明通过对不同遗传背景的育种材料进行抗稻瘟基因型分析，在丰富遗传背景 的基础上适度拓宽双亲遗传距离增强非Fl杂种优势，并可进一步借助抗病基因功能标记辅 助选择(MS)和设施病圃（或病区）鉴定，选育高产持久抗穗瘟水稻品种。利用本发明方法选 育的品系在产量和抗性得到较好的协调，对穗瘟的抗谱及持久抗性水平却得到了显著提 尚。
[0014] 步骤（1)中，符合抗稻瘟病多基因聚合模式"Piz-t+Pita+Pbl"，抗性基因互补，即 父本和母本杂交后的配子含有Piz-t、Pita和Pbl基因。
[0015]作为其中一种实施方式，亲本材料包括镇稻88号、镇8130-6号和武运粳21号。上述 亲本材料具有丰富的遗传背景，可选育出高产、持久穗瘟抗性水稻镇稻WB01。但是并不局限 于本发明所列举的材料，采用其他的水稻材料按照本申请的方法也可实施。
[0016] 步骤(1)中，稻瘟病抗性基因采用功能标记鉴定;步骤(2)中，聚合育种中采用功能 标记辅助选择含稻瘟病抗性基因的水稻植株。分子标记操作简单，准确易行，显著提高育种 效率。
[0017] Piz_t、Pita的分子标记可采用文献中所报道的，Pbl的分子标记为包含Pbl基因编 码区上游926bp~1085bp的DNA片段。
[0018] 所述Pbl的分子标记如SEQ ID NO.3所示，或为包含SEQ ID NO.3所示序列的DNA片 段。SEQ ID N0:3为本发明引物扩增出的159bp片段，扩增区域为Pbl基因编码区上游926bp ~1085bp〇
[0019] 所述Pbl的分子标记正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的碱基序 列如SEQ ID NO.2所示。
[0020] 所述Pbl的分子标记的检测方法，包括：
[0021] (1)根据所述的稻瘟病抗性基因 Pbl功能特异性分子标记的核苷酸序列设计引物；
[0022] (2)以被检测水稻的基因组DNA作为模板进行PCR扩增；
[0023] (3)判断PCR扩增产物中是否存在所述的分子标记。
[0024] 一种实施方式，所述Pbl的分子标记的引物包括：
[0025] 正向引物:ATCAACGCTACCTTCCC;
[0026] 反向引物:GTGCCATCACAATTTCTTC。
[0027] 采用上述引物时，PCR扩增的体系为：1.5μ1基因组DNA，0.5μ1 2mM上游引物，0.5μ1 2mM下游引物，1·2μ1 IOXTaq Buffer，0.3yl ImM (1ΝΤΡ，0·1μ1 1000U Taq DNA聚合酶， ddH20补足至IOyl13PCR扩增的程序为:95°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延 伸40s，运行33个循环；最后72°C lOmin。
[0028] Fl超亲优势是指杂种(Fl)的某一性状平均值减去高值亲本(HP)同一性状平均值 所得的差除以高值亲本(HP)，F1超中亲优势是指杂种(Fl)的某一性状平均值减去双亲(MP) 同一性状平均值所得的差除以双亲均值亲本(MP)，均以百分比表示以百分比表示;本申请 中，Fl产量超亲优势在8%-15 %，进一步为9-11 %，常规稻选育主要利用加性效应，增幅过 大，往往是显性效应和上位性效应(常规稻选育难以利用的效应）；同时，Fl的株高和播始历 期(播种期至始穗期相隔天数)超中亲优势均小于3%。
[0029]步骤(2)为:根据育种目标，采用杂交和自交的方法，筛选出含纯合"Piz-t+Pita+ Pbl"、农艺性状优良的株系;对稳定株系进行田间穗瘟病抗性评价和综合农艺性状评价，筛 选出聚合"Piz-t+Pita+Pbl"且农艺性状优良的水稻株系；所述的育种目标至少包括聚合 "Piz-t+Pita+Pbl" 和抗穗颈瘟。
[0030] 田间穗瘟病抗性评价包括:通过在高氮肥高湿度(每亩施用纯氮22Kg、RH>80% )设 有诱发品种的设施病圃，采用稻瘟病不同生理小种的混合液于孕穗期（具体可以为抽穗前 3-4天）的人工接种鉴定，混合液中，品种目标区域的优势小种和次优势小种占总比例在70 ~80% ;或/和不同生态区稻瘟病重发区的自然诱发鉴定。
[0031] 综合农艺性状评价包括:根据高产、优质、抗倒等育种目标，当选综合农艺性状突 出的个体。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0033] 1.抗性基因 Pita+Piz-t，较好地应对生理小种复杂且变异程度高。
【申请人】对2013 年、2015年江苏省预试品种的抗性基因对江苏不同生理小种的抗性等级相关性分析表明： Piz-t对优势种群ZG的抗性等级呈显著负相关(抗）；Pita与江苏次优势种群ZB和ZC的抗性 等级呈显著负相关(抗）。含抗病基因 Pita+Piz-t的品系对江苏优势(次优势)种群的抗性水 平较高。
[0034] 2.抗性基因 Pbl抽穗期阶段性高表达，高效地强化抗性水平。在植物病害系统中， 病原菌往往通过产生效应子克服寄主植物防卫反应，而植物进化(生产）出相应的识别受体 R蛋白，来识别和防御这些效应子而启动特异性的防卫反应(垂直抗性）。所以，抗病机制的 运行，是要消耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗）品种往往与其产量有一定负相关。抗病基 因 Pbl非组成型表达，仅在穗期以后(产量形成最关键时期)增强表达，是一个"节能型"抗性 基因，有利于高产与抗性的结合。此外，Pbl基因来源于抗源Modan，在日本已成功应用了30 多年，未出现抗性退化，是持久抗穗瘟基因。育种实践证明：2014年、2015年在苏、皖稻区稻 瘟病暴发，镇稻系列品种对稻瘟病的田间抗性好，与其含有Pb 1抗性基因有直接的关系。
[0035] 3.丰富的遗传背景，是实现高产高抗的遗传基础。亲本中至少有一个亲本具有推 广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘，其基因组可能存在着主要病害的复杂防卫机制 的遗传背景，延长抗性基因的使用年限；在此基础适度拓宽双亲的遗传距离，增强杂种优 势，保障抗性能量(ATP)消耗，实现高产与高抗有机结合。
[0036] 4.关于Pbl分子标记。现有技术中，日本研究者已经开发了与Pbl连锁的RFLP标记。 但存在三个不足:①实验操作繁琐，检测效率低。由于RFLP标记需要用限制性内切酶酶切 DNA、凝胶电泳分开DNA片段、转移滤膜及用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段等步 骤，实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种。②选择有误差，准确 率不高。由于此标记位于抗性基因 Pbl的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，在减数 分裂过程中选择标记与目标基因可能发生交换，容易出现错选的情况，选择准确率不高。③ 连锁标记应用有局限性。连锁标记可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中选择，需对亲 本的多态性进行检测；限制了标记在非多态群体的使用。在随后利用抗性基因 Pbl的研究， 也有报道SSR标记RM26998作为连锁标记，虽实验操作简便，但选择效率不高和应用局限性 仍未得到解决。
[0037] 本发明分子标记是功能标记，可特异性检测Pbl基因。因 Pbl基因位于一个以60-kb 为单位的串联重复序列中，Pbl与抗病基因 P5紧密连锁，且Pbl基因与P5基因编码的蛋白只 有一个谷氨酸的差异，而Pbl发挥功能取决于基因编码区上游l_2056bp序列，
【申请人】发现P5 和Pbl均含l-1016bp序列，而Nip(感病品种日本晴，不含Pbl)无;Pbl和Nip含1017-2056bp序 列，而P5无，因此在Nip和P5序列的边界处设计引物，可特异扩增Pbl片段，检测的准确性高。 本发明设计的引物特异性好，采用该引物扩增出的SEQ ID N0:3所示分子标记片段大小为 159bp，可直接用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标条带，成本低，操作简便，适合于大规模 的分子育种。
[0038] 5、借助抗稻瘟病基因功能标记实现抗病基因多基因聚合，提高抗稻瘟病育种效 率。
【附图说明】
[0039] 图1为Pbl与P5基因编码区上游I-IOiebp序列比对(框代表后引物位置）；
[0040] 图2为Pbl基因编码区上游1017-2056bp与对应的Nip基因组序列比对(框代表前引 物位置）；
[0041 ]图3为镇稻88系谱图；
[0042] 图4为镇稻11号、15号、18号系谱图；
[0043]图5为江苏省审定品种中Pbl基因检测电泳图；
[0044] 图6为镇稻WBOl系谱图。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0046] 实施例1抗穗瘟基因 Pbl的功能标记的开发
[0047] -、引物设计
[0048] Pbl基因：genebank登录号为AB570371 · I ;P5基因：genebank登录号AB570370.1。 [0049] Pbl位于一个以60kb为单位的串联重复序列中，且Pbl位于第二个重复序列中，与 第一个重复序列中的P5相对应。P5编码的蛋白只比Pbl多了一个谷氨酸，Pbl与P5都具有穗 瘟抗性，但Pbl抗穗瘟能力显著高于P5,两个基因抗穗瘟的差异并不是这个谷氨酸的差异造 成的，而是Pbl的基因表达水平明显高于P5。通过比对Pbl与P5基因编码区上游启动子区发 现，基因编码区上游IOiebp的启动子序列完全匹配（图1)，而感病品种（以Nip即日本晴为 例）不含这段序列；基因编码区上游l〇17bp-2056bp处，Pbl与Nip序列大部分匹配（图2)，而 P5不含这段序列。l-1016bp和1017-2056bp序列同时存在，Pbl才能发挥功能。因此，我们将 前引物SEQ ID N0:1设计在1017-2056bp之间，后引物SEQ ID N0:2设计在l-1016bp之间，能 够特异检测Pbl基因。
[0050]正向引物（即前引物）：ATCAACGCTACCTTCCC [0051 ]反向引物（即后引物）：GTGCCATCACAATTTCTTC [0052]二、Pbl检测的实验流程
[0053]对江苏省审定品种中镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁9108、镇稻19号、 镇稻18号、镇稻14号进行检测。
[0054]步骤一、DNA 提取（SDS法）：
[0055] 1、将2cm长的叶片剪碎置2ml的离心管中，加上钢珠，然后放入装液氮的保温瓶中 速冻，快速捞取放在48孔模具上，盖好盖子置于磨样机上震动30s，取下离心管，倒出钢珠。 [0056] 2、在含有液氮磨碎的叶片的2ml离心管中，加入SDS(0.1 M Tris-Hcl，PH 8.0; 0.025M EDTA，PH 8.0;29.25g/l Nacl;12g/1 SDS)600yl，放置65°C水浴锅中，30min。
[0057] 3、加入 150μ1 KAc(PH 4.8)，放置-2(TC冰箱，30min。
[0058] 4、加入与SDS等体积的氯仿：异戊醇（体积比为24:1)溶液，放置振荡器充分摇匀， 20min〇
[0059] 5、离心，12000rpm，4min，转移200μ1上清液置1.5ml离心管中D
[0060] 6、在上清液中加入2倍体积-20 °C预冷的无水乙醇，置于-20 °C冰箱，20min。
[0061 ] 7、离心，12000rpm，4min，弃上清，风干，加入200μ1 ddH2〇溶解，此为DNA母液。
[0062] 8、将母液稀释10倍即为DNA工作液。
[0063] 9、取1·5μ1用于PCR扩增反应。
[0064] 步骤二、PCR扩增：
[0065] PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0066] 1、反应体系如下：
[0067] 总体积：10μl。DNAl·5μl;2mMSEQIDN0:l上游引物0·5μl ;2mMSEQIDN0:2下 游引物0.5yl;10XTaq Buffer(GENERAY，捷瑞公司）1·2μ1，1πιΜ dNTP 0·3μ1，100〇υ Taq DNA聚合酶(GENERAY)O. ΙμL，加 CldH2O补足至 10μ1。
[0068] 2、PCR的扩增程序如下：
95'C 94'C
[0069] 55 °C(引物退火温度） 72Γ 72 0C
[0070] 4 4C
[0071] 步骤三、PCR产物检测：
[0072]用8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，取扩增好的PCR产物2μ1，以DNAMarker (IOObp-IDNA ladder)作为分子量对照，在240V恒压下电泳1小时。银染显示DNA条带，通过 比对DNA Marker找到目标条带，根据片段大小判断抗感基因：用引物对SEQ ID NO: GPSEQ ID NO: 2检测，159bp为含Pbl，不含Pbl则扩增不出条带。
[0073]结果如图5,样品顺序（从左到右）为：镇稻88、镇稻11号、武育粳23、镇稻15号、宁 9108、镇稻19号、镇稻18号、镇稻14号，M代表Marker。在这8个水稻品种中，镇稻88、镇稻11 号、镇稻15号和镇稻18号检测到Pbl基因，其余水稻品种未检测到Pbl基因。
[0074] 三、江苏省审定品种Pbl基因检测
[0075] Pb 1基因来自籼稻品种Modan，而镇稻88由Modan衍生而来（图3 )，镇稻88田间穗瘟 抗性好，通过Pbl基因的功能标记检测发现其含有Pbl。而镇稻11号、15号、18号皆由镇稻88 衍生而来(图4)，这三个品种也检测到了Pbl基因，与其田间抗穗瘟表型相一致。
[0076] 实施例2 Pita、Piz-t功能标记及引物
[0077] Pita、Piz_t功能标记及引物均采用现有技术中已经公开的分子标记及引物序列 (表1)。利用Pita引物检测到1042bp片段，同时Npita引物扩增不出目的片段，这样的材料含 有Pita基因；利用Piz-t的功能标记引物对两种不同类型材料扩增时，含有一条160bp的目 标条带只有A碱基类型（含Piz-t基因），含有一条221bp的目标条带只有G碱基类型（不含 Piz-t基因），331bp的目标条带是A碱基类型（含Piz-t基因）和G碱基类型（不含Piz-t基因） 共有条带。
[0078] 抗病基因 Pita检测的实验流程按照参考文献[1]，略作修改:①在扩增程序中，72 °C延伸用的是Imin;②电泳是用4%的聚丙烯酰胺凝胶。
[0079] 抗病基因 Piz-t检测的实验流程按照参考文献[2]，电泳是用8%的聚丙烯酰胺凝 胶。
[0080] 表1弓丨用的功能标记引物及其扩增片段
[0083] 参考文献：
[0084] [ 1 ].范方军，王芳权，刘永峰，等.Pi-b、Pi_ta、Pikm和Pi54对水稻穗颈瘟的抗性评 价[J] ·华北农学报，2014,29(3) :221-226。
[0085] [2].蔡海亚，周雷，闸雯俊，等.水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特异性分子标记开发及应 用[J]，分子植物育种，2015,13(7): 1457-1461。
[0086] 实施例3抗性基因多基因聚合模式"Pita+Pbl+Piz-t"抗性评价。
[0087]采用实施例1的分子标记，对2015年江苏省227份预试材料进行对抗病基因 Pita、 Pbl和Piz-t进行基因型分析。结果表明：15份品系（含Pita+Pbl+Piz-t)，有7份材料综合病 指低于4.0(中抗以上），中抗稻瘟病组合概率46.47 % ; 51份品系（不含Pita+PbI +Piz-t)，仅 有7份材料综合病指低于4.0(中抗以上），中抗稻瘟病组合概率13.73% ;中抗稻瘟病成功概 率提高了 32.74个百分点。
[0088]表2聚合模式"Pita+Pbl+Piz-t"的不同类群的稻瘟病相关指数均值的比较
[0090]备注：中抗以上是指综合病指低于4.0,效应值=类群I的均值减去-类群II均值， 类群I含抗病基因"Pita+Pbl+Piz-t"，类群II不含抗病基因"Pita+Pbl+Piz-t"。
[0091] 实施例4镇稻WBOl的选育
[0092]以江苏丰源种业公司和江苏丘陵地区镇江农业科学研究所合作培育的迟熟中粳 新品系镇稻WBO1为实施例：
[0093]亲本的选择:采用实施例1的分子标记对现有的一些水稻材料进行检测，确定水稻 稻瘟病抗性基因类型，最终选择携带抗性基因 Pbl的镇稻88号以及携带抗性基因 Piz-t的育 种中间材料镇8130-6(亲本镇稻540/运9707;由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所种质资 源中心提供）、含抗病基因 Pita的武运粳21号作为育种材料。
[0094] 1.选育经过：
[0095] 1)、2008年正季，以镇稻88号（含抗病基因 Pbl)为母本，以镇8130-6(含抗病基因 Piz-t)做父本，得Fo种子34粒；
[0096] 2)、2008年冬在海南种20株，去杂后混收；
[0097] 3)、2009年正季种植（5月15日播种)F2代576株，根据丰产性(单株产量在>35克）、 熟期（抽穗期在8月22日至8月28日）、外观品质(垩白率〈25%)性状进行初筛，利用抗稻瘟病 基因 Pbl、Piz-t的功能标记检测，当选含Pbl+Piz-t迟熟中粳5株；
[0098] 4)、2010年正季种植?3代5个株系，选1系抗性基因？131+?丨24基因型纯合的单株， 与武运粳21号(含抗病基因 P i ta)杂交，得CFo种子64粒；
[0099] 5)、2010年冬在海南种植0?1代20株，去杂后混收；
[0100] 6)、2011年正季在句容种植(5月15日播种)CF2代1208个株系，根据步骤3)当选20 株含Pita+Pbl+Piz-t迟熟中粳15株；
[0101] 7 )、2011年冬在海南分株系种植CF3代，混收。
[0102] 8)、2012年正季在句容分株系种植0?4代，当选5个丰产株系，共选择含？丨丨&+?131 + Piz-t迟熟中粳18株；
[0103] 9)、2012年冬在海南分株系种植CF5R，混收；
[0104] 10)、2013年正季在句容种植CF6代18个株系，进行穗颈瘟人工和产量鉴定试验，选 留1个表现为抗穗颈瘟、抗倒伏、优质高产株系。人工接种穗颈瘟人工接种是在高氮肥(每亩 施用纯氮22Kg)、高湿度水平(RH>80%)下，于孕穗期（具体为抽穗期3-4天）用注射器注射 ImL孢子悬浮液;孢子悬浮液在已配成10 X 10倍显微镜下每视野30-40个孢子的生理小种， 按生理小种体积比（ZG1: ZB27: ZC15: ZD7: ZE3: ZF1 = 35:20:20:9:8:8)混合而成。
[0105] 11)、2014年正季在句容进行品比试验，表现优质高产、尤抗穗颈瘟，暂定名镇稻 WBOl (含抗性基因 Pita+Pbl+Piz-t)。
[0106] 2.特征特性
[0107]对镇稻WBOl的综合性状鉴定，鉴定方法为本领域通用方法。
[0108] 1)稻瘟病抗性突出，综合抗性好。
[0109]镇稻WBOl于2015年在本所、浙江、安徽高氮肥自然诱发鉴定圃中，穗瘟发生轻，明 显好于生产上同类型主推品种(如武运粳24号、宁9108等）。此外，对白叶枯病、稻曲病、纹枯 病和条纹叶枯病均具有较好的抗性。
[0110] 2)穗粒结构协调，产量潜力大。
[0111] 镇稻WBO1在2015年本所鉴定试验中，平均产量折合亩产753.2kg，较对照（武运粳 24号）增产4.68 %。每亩有效穗20.8万，每穗总粒数153.8粒，结实率97.26 %，千粒重29.75 克;亩颖花量大，产量潜力大，稳产性好。
[0112] 3)综合农艺性状突出。
[0113] 镇稻WBOl全生育期149天，比对照短(武运粳24号）3天，株高适中（94. Ocm左右），比 对照矮1.9cm，株型紧凑，倒性强。稻米品质国标2级。
[0114] 3.优异特性的成因分析。
[0115] 1)镇稻WBOl具有丰富的遗传背景。融合了大面积500万亩以上主推品种镇稻88、武 运粳21号及香粳9325的遗传背景，具有日本亲缘、太湖流域亲缘、杭嘉湖亲缘、东北稻亲缘 和籼稻亲缘，具有丰富的遗传背景（图6)，为聚合高产稳产高抗稻瘟病奠定了丰富的遗传基 础。Fl产量超亲优势为10.5%，F1的株高和播始历期超中亲优势分别为1.8和1.1 %。
[0116] 2) "Pita+Pbl+Piz-t"多基因聚合，实现不同抗病防御机制的有机结合。Pita和 Piz-t是完全抗性基因，对江苏优势种群ZG(次优势种群ZB和ZC)的抗性水平较高，产生基因 的加性效应，拓宽了抗谱;部分抗性基因 Pbl自孕穗期起表达量逐步升高，在水稻抗性脆弱 时期（抽穗期)和产量形成的关键时期（灌浆期），抗性阶段性加强，大大降低了稻瘟病菌的 侵染。此外，Pbl基因来源于抗源Modan，在日本成功应用了 30多年，未出现抗性退化，是个持 久抗病基因。
[0117] 3) "节能型"抗性基因 Pbl的利用，有利于高产与抗性的结合。抗病机制的运行，是 要消耗一定的能量(ATP)，即高抗(多抗）品种往往与其产量有一定负相关。Pbl基因仅在抽 穗灌浆阶段表达量提高，在其它苗期和分蘖期不表达，减少能量消耗，有利于高产与抗性的 结合。
【主权项】
1. 一种培育抗稻瘟病的水稻品种的方法，其特征在于，包括： (1) 亲本选择:对水稻材料进行稻瘟病抗性基因的鉴定，在水稻材料中根据以下配组原 则组配优势组合： 亲本中至少有一个含有累计推广面积在500万亩以上的主推品种的亲缘； 符合抗稻瘟病多基因聚合模式"Pita+Pb 1+Piz-t"，抗性基因互补； 根据双亲系谱和形态差异，适度拓宽双亲遗传距离，使F1产量超亲优势在8%-15%，Fl 的株高和播始历期超中亲优势均小于3% ; (2) 根据育种目标，对亲本材料进行聚合育种，获得穗瘟病抗性水稻品种;所述的育种 目标至少包括聚合"Pita+Pbl+Piz-t"和抗穗颈痕。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，稻瘟病抗性基因采用分子标记 鉴定;步骤(2)中，聚合育种中采用分子标记辅助选择含稻瘟病抗性基因的水稻植株。3. 根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，Pbl的分子标记为包含Pbl基因编码区 上游926bp~1085bp的DNA片段。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Pbl的分子标记如SEQ ID NO.3所示，或为 包含SEQ ID从).3所示序列的0嫩片段。5. 根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，Pbl的分子标记引物包括： 正向引物:ATCAACGCTACCTTCCC; 反向引物：GTGCCATCACAATTTCTTC。6. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，亲本包括:镇稻88号、镇8130-6号和武 运粳21号。7. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤(2)为:根据育种目标，采用杂交 和自交的方法，筛选出含纯合"Pita+Pbl+Piz-t"、农艺性状优良的株系;对稳定株系进行田 间穗瘟病抗性评价和综合农艺性状评价，筛选出聚合"Pita+Pbl+Piz-t"且农艺性状优良的 水稻株系;所述的育种目标至少包括聚合"Pita+Pbl+Piz-t"和抗穗颈瘟。8. 根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，田间穗瘟病抗性评价包括:建立设施 病圃，采用稻瘟病不同生理小种的混合液于孕穗期进行人工接种鉴定，混合液中，品种目标 区域的优势小种和次优势小种占比为70~80%;或/和不同生态区稻瘟病重发区的自然诱 发鉴定。
【文档编号】A01H1/02GK105961185SQ201610305997
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】林添资, 龚红兵, 景德道, 孙立亭, 余波, 钱华飞, 曾生元, 李闯, 姚维成, 盛生兰, 周义文
【申请人】江苏丘陵地区镇江农业科学研究所