一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
【专利摘要】本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法。该选育方法包括：以易于建立遗传转化体系的玉米品种为母本，以农艺性状优良的玉米品种为父本，进行杂交，取杂交果穗的幼胚进行遗传转化，在遗传转化效率高的杂交果穗中选择植株农艺性状优良的杂交果穗，将其籽粒播种，自交；选择农艺性状优良的植株的果穗幼胚进行遗传转化，将遗传转化效率高的自交果穗籽粒播种，自交；重复前一步操作。本发明选育方法所选育的自交系综合了亲本相关优点，再生容易、抗逆性好、遗传稳定性高，农艺性状优良，有效克服现有受体材料遗传转化效率偏低等技术缺陷，易于建立遗传转化体系，为目前玉米转基因提供了新的受体。
【专利说明】
一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及农业技术领域，特别涉及一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育 方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上三大主要粮食作物之一，也是重要工业原料和生物能源物质，在世 界农业生产上有着举足轻重的地位。我国作为发展迅速的发展中国家，对玉米的需求与日 倶增。而在耕地日益减少的环境下，培育品质产量优良的玉米新品种是解决这一问题的重 要途径。目前，玉米新品种的选育主要靠常规育种方法，根据表型进行人工选择，实现优良 基因重组。但由于表型易受外界环境季节影响，育种的周期长，规模大，且相对效率低，预见 性也较差。另外，由于有性杂交的种间隔离因素，也严重限制了外源基因在玉米中的应用。
[0003] 常规育种技术已无法满足社会对玉米新品种的迫切需求，迅速发展的植物基因工 程技术可以打破物种间隔离，导入外源优良基因，定向改良物种的遗传性状，弥补了常规育 种的不足，其应用必将大大推进高产、优质、高抗新品种的选育进程，因此玉米的遗传转化 研究具有明显的应用和理论意义。
[0004] 玉米的遗传转化方法主要分为两类:载体介导法和DNA直接导入法。但这些方法基 本上都需要先建立玉米的植株再生体系，才能实现外源基因的转移，从而获得转基因植株， 所以建立遗传稳定性强、转化效率高、易于再生的受体系统是玉米转基因研究的关键之一， 它在很大程度上决定了玉米转基因的成功与否。
[0005] 目前，玉米转基因转化效率较高的主要集中在模式自交系A188和B73及其衍生系 和杂交种，这两个品种因使用年代较久、生活力较弱、抗逆性也较差，综合性状远远不能满 足生产要求，所以在育种上没有什么直接应用价值;而生产上综合性状优良的自交系又通 常难以诱导出愈伤组织，或诱导效率低，或再生能力差，很难提供稳定、充足的转基因受体 材料，因而使转基因玉米应用受到限制。因此，培育一种易于建立再生及遗传转化体系并且 农艺性状优良的玉米自交系及其选育方法，对于玉米分子育种来说意义重大。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法。该选 育方法所选育的自交系综合了亲本相关优点，抗逆性好、遗传稳定性高，农艺性状优良，有 效克服现有受体材料遗传转化效率偏低等技术缺陷，易于建立遗传转化体系。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法，包括如下步骤：
[0009] (1)以易于建立遗传转化体系但综合品质较差的玉米品种为母本，以农艺性状优 良但难以建立遗传转化体系的玉米品种为父本，进行杂交，得到杂交果穗；
[0010] (2)取杂交果穗的幼胚进行遗传转化，获得遗传转化效率高的杂交组合；
[0011] (3)在遗传转化效率高的杂交组合中选择植株农艺性状优良的杂交果穗，将其籽 粒播种，自交；
[0012] (4)选择农艺性状优良的植株，取农艺性状优良的植株的果穗幼胚进行遗传转化， 获得遗传转化效率高的自交果穗，将其籽粒播种，自交；
[0013] (5)重复步骤(4)操作，获得适合作为转化受体的玉米自交系。
[0014]大量研究表明，基因型是外植体形成的愈伤组织重要限制因素，也就是说玉米的 遗传转化受基因型限制很大。Hodge等（Genotype specificity of somatic embryogenesis and regeneration in maize .Biotechnology 4:219-223; 1986)发现在相 同的培养条件下，A188的再生能力明显高于其它品系，以其作为亲本的杂交后代也表现出 较高的再生频率。夏燕莉(玉米幼胚培养胚性愈伤组织诱导及绿苗再分化的遗传机理.四川 农业大学硕士论文，2002)通过研究表明在愈伤诱导率和再分化数两个性状上存在这样的 规律，双亲都表现较高则组合一般表现较高，双亲都表现较低的组合一般表现较低，表现高 的亲本与表现低的亲本杂交，其组合均值分布范围较广，但都不同程度地比原来的表现低 的亲本有所提高。本申请选择了易于建立遗传转化体系但综合品质较差的玉米品种ΗΠΙΑ、 Hi IIB为母本，综合品质较好但难于建立遗传转化体系的优良自交系Z31、郑58、PH6WC、 PH4CV、齐319、昌7-2、H19、9058为父本，分别进行授粉杂交，在后代中选育易于建立遗传转 化体系且品质性状较好的稳定自交系，进而作为转化受体，以实现更多优良基因在玉米上 快速更好的应用。
[0015]作为优选，易于建立遗传转化体系但综合品质较差的玉米品种为HiIIA或ΗΠΙΒ。 [0016]作为优选，农艺性状优良但难以建立遗传转化体系的玉米品种为Z31、郑58、 PH6WC、PH4CV、齐319、昌 7-2、H19或9058中的一种。
[0017]作为优选，步骤(3)中农艺性状优良的杂交果穗的个数为5~20。
[0018] 在本发明提供的实施例中，步骤(3)中农艺性状优良的杂交果穗的个数为10。
[0019] 作为优选，步骤⑵或步骤⑷中幼胚的长度为1.〇~1.5mm。
[0020] 在本发明提供的实施例中，步骤（1)、步骤(3)或步骤(4)中农艺性状为株型、抗病 性或抗逆性中的一种或几种。
[0021] 作为优选，重复步骤(4)操作的次数不少于4次。
[0022] 在本发明提供的实施例中，遗传转化为：
[0023]将幼胚经农杆菌浸染后接种到共培养基进行共培养，经过恢复培养和第一轮抗性 愈伤筛选和第二轮抗性愈伤筛选后得到抗性愈伤组织;将得到的抗性愈伤组织进行胚状体 诱导培养;再将所得到胚状体转接到分化培养基进行分化培养，经过生根培养得到玉米再 生植株。
[0024]在本发明提供的实施例中，共培养的条件为23°C共培养3天；
[0025] 恢复培养的条件为暗培养7天，以消除农杆菌并为幼胚生长提供恢复期；
[0026] 第一轮抗性愈伤筛选的时间为2周，第二轮抗性愈伤筛选的时间为2周；
[0027]胚状体诱导培养的条件为28°C黑暗培养2周；
[0028] 分化培养的条件为28°C、光照强度2000~23001x、每天光照14~18h条件下培养2 ~3周；
[0029] 生根培养的条件为28°C、光照强度20001x~23001x、每天光照14h~18h条件下培 养2周。
[0030] 在本发明提供的实施例中，侵染所采用的侵染液的配方为:N6培养基、B5微量元素 营养液100倍母液l〇ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、 L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)2mg/L、肌醇O.lg/L、水解酪蛋白0.2g/L、AS 100μΜ、ρΗ 5.2)中，并将其浓度调整0D_ = 0.4~0.6。
[0031] 在本发明提供的实施例中，共培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100 倍母液l〇ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、鹿糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯 苯氧乙酸（2，4-D) 2mg/L、硝酸银IOmg/L、肌醇0 · Ig/L、水解酪蛋白 0 · 2g/L、AS 1 ΟΟμΜ、pH5 · 8; 其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液50ml/L， 所述铁盐100倍母液l〇ml/L;
[0032] 恢复培养采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液IOml/ L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2，4_二氯苯氧乙酸(2， 4-D) 2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0 · I g/L、水解酪蛋白0 · 2g/L、羧苄青霉素300mg/L、pH5 · 8;其 中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液50ml/L，所 述铁盐100倍母液l〇ml/L;
[0033] 第一轮抗性愈伤筛选采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍 母液10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯 氧乙酸（2,4-D)2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/ L、草甘膦ImM、pH5.8;其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元 素20倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L;
[0034] 第二轮抗性愈伤筛选采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍 母液10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯 氧乙酸（2,4-D)2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/ L、草甘膦2mM、pH5.8;其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元 素20倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L;
[0035] 胚状体诱导培养采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液 10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖60g/L、L-脯氨酸0.7g/L、肌醇0.1g/L、水解 酪蛋白〇.2g/L、6-BA 5mg/L、植物凝胶3g/L、pH 5.8;其中，册培养基包括大量元素20倍母液 和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L;
[0036]分化培养基的配方为:MS培养基4.3g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8;
[0037] 生根培养采用的培养基的配方为:MS培养基4.3g/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和植 物凝胶3g/L，pH 5.8。
[0038] 在本发明中，步骤(2)中遗传转化效率高的杂交果穗所属组合为HiIIAXZ31。
[0039] 在本发明中，步骤(3)中植株农艺性状优良的杂交果穗为:植株农艺性状优良的杂 交果穗是经过株型、抗病性、抗逆性等农艺性状的选择后表现最佳的多个单株。在本发明提 供的实施例中，选择表现最佳的10个单株。
[0040] 在本发明中，步骤(4)中选择农艺性状优良的植株是在多个Fl代杂交果穗后代穗 行中选择的多棵植株，其是经过株型、抗病性、抗逆性等农艺性状的选择后表现最佳的多棵 植株。在本发明提供的实施例中，选择表现最佳的20棵植株。
[0041] 作为优选，在重复步骤(4)操作和获得适合作为转化受体的玉米自交系之间还包 括自交2次，得到稳定的适合作为转化受体的玉米自交系。
[0042]本发明提供了一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法。该选育方法包 括：以易于建立遗传转化体系的玉米品种为母本，以农艺性状优良的玉米品种为父本，进行 杂交，得到杂交果穗;取杂交果穗的幼胚进行遗传转化，获得遗传转化效率高的杂交组合； 在遗传转化效率高的杂交组合中选择植株农艺性状优良的杂交果穗，将其籽粒播种，自交； 选择农艺性状优良的植株，取农艺性状优良的植株的果穗幼胚进行遗传转化，获得遗传转 化效率高的自交果穗，将其籽粒播种，自交;重复前一步操作，获得适合作为转化受体的玉 米自交系。本发明具有如下技术效果：
[0043] 本发明选育方法所选育的自交系综合了亲本相关优点，再生容易、抗逆性好、遗传 稳定性高，农艺性状优良，有效克服现有受体材料遗传转化效率偏低等技术缺陷，易于建立 遗传转化体系，为目前玉米转基因提供了新的受体；
[0044] 本发明选育方法所选育的自交系打破了目前仅限于依靠少数自交系作为遗传转 化受体的局限，缩短了利用转基因技术培育玉米新品种的时间，是一种可实现外源基因在 玉米中快速广泛应用的新自交系。
【附图说明】
[0045] 图1示本发明玉米自交系选育方法示意图；
[0046] 图2示部分转基因植株PCR鉴定结果，其中，M为DL2000DNA marker; 1-13为13个To 代植株；14为已知阳性转基因植株对照；15为非转基因玉米自交系；16为质粒 pM3301UbiSpAM79;17 为水。
【具体实施方式】
[0047] 本发明公开了一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法，本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0048]本发明提供的适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法中所用玉米品种、培养 基成分、试剂、引物或其它生物材料等均可由市场购得。
[0049] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0050] 实施例1适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法
[0051] 本发明选育方法示意图见图1，具体步骤及结果如下：
[0052] 第一步：将母本汜11厶、汜118和父本231、郑58、卩!16^：、？!14(^、齐319、昌7-2、!119、 9058在最适季节种于大田，选取长势优良的母本父本进行杂交。
[0053]第二步:对授粉后的16种杂交果穗分别取幼胚进行遗传转化。各杂交组合Fl代幼 胚的遗传转化过程如下：
[0054] 玉米幼胚的剥取:HiIIA、HiIIB分别与父本Z31、郑58、？册賈：、？財(^、齐319、昌7-2、 Hl9、9058杂交授粉后9-13d后，幼胚长度为1.0-1.5_时，剥取幼胚。
[0055]农杆菌菌液的制备：用枪头挑取携带草甘膦抗性基因的农杆菌在加有卡那霉素 50mg/L、利福平40mg/L的固体YEP培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、植 物凝胶3.5g/L、pH7.2)上划线，在28 °C黑暗条件下培养2-3天。挑取单菌落在新的YEP液体培 养基(酵母提取物l〇g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、pH7.2)上过夜至对数生长期，然后悬浮 在侵染液【N6盐(大量元素20倍母液50ml/L，铁盐100倍母液10ml/L)、B5微量元素（100倍母 液 10ml/L)、B5维生素（100倍母液 10ml/L)、蔗糖68 · 5g/L、葡萄糖36g/L、L-脯氨酸0 · 7g/L、2， 4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) 2mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、AS 100μΜ、pH 5.2】中，并 将其浓度调整OD6QQ = 0.4-0.6。
[0056]农杆菌侵染玉米幼胚:将幼胚用侵染液清洗2遍，接着将侵染液吸出后再加入农杆 菌菌液，颠倒几次后将离心管平放5分钟;将侵染后的幼胚从离心管中倒出，置于放滤纸的 培养皿上，将幼胚上残存的农杆菌菌液彻底吸干。
[0057]农杆菌与玉米幼胚共培养：将吸干农杆菌菌液的愈伤组织转移到共培养培养基 【N6盐(大量元素20倍母液50ml/L，铁盐100倍母液10ml/L)、B5微量元素（100倍母液IOml/ L)、B5维生素（100倍母液10ml/L)、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、AS 10(^1、卩!15.8】上，23°(：共培养3 天。
[0058]玉米幼胚的恢复培养:将共培养后的幼胚转移到恢复培养基【N6盐(大量元素20倍 母液50ml/L，铁盐100倍母液10ml/L)、B5微量元素（100倍母液10ml/L)、B5维生素（100倍母 液 10ml/L)、蔗糖 30g/L、L-脯氨酸 0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、硝酸银 10mg/L、 肌醇〇. lg/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/L、pH5.8】上，暗培养7天，以消除农杆菌 并为幼胚生长提供恢复期。
[0059]玉米抗性愈伤组织的筛选:恢复期结束后，将幼胚转移到筛选培养基【N6盐(大量 元素20倍母液50ml/L，铁盐100倍母液10ml/L)、B5微量元素（100倍母液10ml/L)、B5维生素 (100 倍母液l〇ml/L)、蔗糖 30g/L、L-脯氨酸 0.78/1、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-0)211^/1、硝酸 银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/L、草甘膦lmM、pH5.8】±i 转化的愈伤组织选择性生长。筛选2周后转到含草甘膦2mM的筛选培养基上再筛选2周，然后 获得抗性愈伤组织。
[0060]玉米抗性愈伤组织再生成植株:将抗性愈伤组织转移到胚状体诱导培养基上【N6 盐(大量元素20倍母液50ml/L，铁盐100倍母液10ml/L)、B5微量元素（100倍母液10ml/L)、B5 维生素（100倍母液l〇ml/L)、蔗糖60g/L、L-脯氨酸0.7g/L、肌醇0. lg/L、水解酪蛋白0.2g/L、 6-BA 5mg/L、植物凝胶3g/L、pH 5.8;】黑暗条件下诱导2周，然后转移至MS分化培养基(MS培 养基4.3g/L，蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8)分化出抗性植株;抗性植株在转移至生根 培养基(MS培养基4.3g/L、NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8)培养2周;然后 移至温室培养至结实。
[0061 ]玉米抗性植株PCR检测：以下引物用来检测抗性植株中目的基因序列：
[0062] 引物 I: GGTGACGCCGACCTCCAACAAG
[0063] 引物2: TGTGGTCGTCGTGCGGGTTCGA
[0064] PCR反应体系为：
[0065] 25yL体系中，模板：2yL; 10 XPCR buffer: 2 · 5yL;MgCl2:1 · 5yL; dNTP: 0 · 5yL;引物： 各IyL(浓度为 10ymol/L) ;Taq DNA polymerase(TaKaRa) :0.2yL;ddH2〇: 16.3yL;
[0066] PCR反应程序为：
[0067] 94 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30s，65 °C 退火 30s，72 °C 延伸 60s，30 个循环；72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
[0068] 图2示部分转基因植株PCR鉴定结果。从图中可以看出编号为2、4、5、8、11的转基因 植株中包含草甘膦抗性基因，实验结果表明，目的基因序列已初步整合到所检测的玉米植 株的基因组中。
[0069] 根据PCR鉴定结果统计遗传转化效率。各杂交果穗的遗传转化效率见表1。
[0070] 第三步:选择转化效率最高的杂交组合。从表1中结果可知遗传转化效率最高的杂 交组合为Hi IIAX Z31。
[0071] 第四步:从转化效率最高的杂交组合中选择10个农艺性状优良的Fl代杂交果穗， 将每个果穗籽粒单粒播种，单株套袋自交。
[0072]第五步:从这10个F2代穗行中每个穗行选择20棵农艺性状优良的植株，其中10棵 取其幼胚进行遗传转化。结果见表2。
[0073] 第六步:根据每个穗行幼胚的遗传转化效率，将转化效率最高的穗行中剩下的10 棵农艺性状优良的植株果穗籽粒继续单粒播种，单株套袋自交；
[0074] 第七步:继续按照步骤5和6的选择方法，连续自交5代，选择出转化效率最好的株 系ZH7-5-4-3-7，遗传转化效率可达2.27%，最后再自交2次育成稳定的玉米自交系。HiIIA 父231组合?3、？4、？5、？6代10个株系遗传转化效率分别见表3、4、5、6。
[0075] 表1Hi IIA、Hi IIB及其与各父本杂交组合Fl代幼胚遗传转化效率
[0084] 表5 HiIIAXZ31组合F5代10个株系遗传转化效率
L0089」 以上所还彳乂是本友明的优选买施万式，应当指出，对亍本扠木领域的晋通扠木人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种适合作为转化受体的玉米自交系的选育方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 以易于建立遗传转化体系但综合品质较差的玉米品种为母本，以农艺性状优良但 难以建立遗传转化体系的玉米品种为父本，进行杂交，得到杂交果穗； (2) 取所述杂交果穗的幼胚进行遗传转化，获得遗传转化效率高的杂交组合； (3) 在所述遗传转化效率高的杂交组合中选择植株农艺性状优良的杂交果穗，将其籽 粒播种，自交； (4) 选择农艺性状优良的植株，取所述农艺性状优良的植株的果穗幼胚进行遗传转化， 获得遗传转化效率高的自交果穗，将其籽粒播种，自交； (5) 重复步骤(4)操作，获得适合作为转化受体的玉米自交系。2. 根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述易于建立遗传转化体系但综合品 质较差的玉米品种为HiIIA或ΗΠΙΒ。3. 根据权利要求1或2所述的选育方法，其特征在于，所述农艺性状优良但难以建立遗 传转化体系的玉米品种为Z31、郑58、？册1(：、？!14(^、齐319、昌7-2、!119或9058中的一种。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的选育方法，其特征在于，步骤(3)中所述农艺性状 优良的杂交果穗的个数为5~20。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)或步骤(4)中所 述幼胚的长度为1.0~1.5mm。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的选育方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(3)或步骤 (4)中所述农艺性状为株型、抗病性或抗逆性中的一种或几种。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的选育方法，其特征在于，所述重复步骤(4)操作的 次数不少于4次。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的选育方法，其特征在于，步骤(2)或步骤(4)中所 述遗传转化为： 将幼胚经农杆菌浸染后接种到共培养基进行共培养，经过恢复培养和第一轮抗性愈伤 筛选和第二轮抗性愈伤筛选后得到抗性愈伤组织;将得到的抗性愈伤组织进行胚状体诱导 培养;再将所得到胚状体转接到分化培养基进行分化培养，经过生根培养得到玉米再生植 株。9. 根据权利要求8所述的选育方法，其特征在于，共培养的条件为23 °C共培养3天； 恢复培养的条件为暗培养7天； 所述第一轮抗性愈伤筛选的时间为2周，所述第二轮抗性愈伤筛选的时间为2周； 所述胚状体诱导培养的条件为28°C黑暗培养2周； 所述分化培养的条件为28°C、光照强度2000~23001x、每天光照14~18h条件下培养2 ~3周； 所述生根培养的条件为28°C、光照强度20001x~23001x、每天光照14h~18h条件下培 养2周。10. 根据权利要求8或9所述的选育方法，其特征在于，所述共培养基的配方为:N6培养 基、B5微量元素营养液100倍母液10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸〇.7g/L、2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0. lg/L、水解酪蛋白0.2g/L、 AS 100μΜ、ρΗ5.8;其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素 20倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液lOml/L; 恢复培养采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液10ml/L、B5 维生素营养液100倍母液l〇ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.78/1、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-0) 2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0· lg/L、水解酪蛋白0·2g/L、羧苄青霉素300mg/L、pH5·8;其中， N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液50ml/L，所述铁 盐100倍母液l〇ml/L; 第一轮抗性愈伤筛选采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液 10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙 酸2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/L、草甘膦ImM、 pH5.8;其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液 50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L ; 第二轮抗性愈伤筛选采用的培养基的配方为:N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液 10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖30g/L、L-脯氨酸0.7g/L、2,4-二氯苯氧乙 酸(2,4-D)2mg/L、硝酸银10mg/L、肌醇0.1g/L、水解酪蛋白0.2g/L、羧苄青霉素300mg/L、草 甘膦2mM、pH5.8;其中，N6培养基包括大量元素20倍母液和铁盐100倍母液，所述大量元素20 倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L; 胚状体诱导培养采用的培养基的配方为：N6培养基、B5微量元素营养液100倍母液 10ml/L、B5维生素营养液100倍母液10ml/L、蔗糖60g/L、L-脯氨酸0.7g/L、肌醇0.1g/L、水解 酪蛋白〇.2g/L、6-BA 5mg/L、植物凝胶3g/L、pH 5.8;其中，册培养基包括大量元素20倍母液 和铁盐100倍母液，所述大量元素20倍母液50ml/L，所述铁盐100倍母液10ml/L; 分化培养基的配方为:MS培养基4.3g/L、蔗糖30g/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8; 生根培养采用的培养基的配方为:MS培养基4.3g/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g//L和植物凝 胶3g/L，pH 5.8。
【文档编号】A01H4/00GK105941163SQ201610492622
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】何军光, 徐京, 吕洪坤, 张晓丽, 翁嘉慧, 楼亿圆, 吴学莉
【申请人】浙江新安化工集团股份有限公司