一种百合种球脱毒方法
【专利摘要】本发明公开了一种百合种球脱毒方法，包括以下步骤：(1)将百合种球在3?8℃放置40?50天；(2)选取芽长为4?8cm的百合种球，剥去外层鳞片，留3?5个内层鳞片的鳞茎盘，将鳞茎盘放入培养箱中进行预处理，预处理条件为：光照强度1500?2000Lux，温度35?40℃，处理时间2?5天；(3)选择生长正常的鳞茎盘，剥取0.4?0.7cm的茎尖移入分化培养基中，先在23?25℃下暗培养1?2天，然后移入光照培养箱中，光照强度为1500?2000Lux，光照时间为12?16小时/天，并以1?5℃/d的速度升温，温度升至35?45℃后，保持该温度培养35?45天。本发明将热处理和化学处理结合脱除百合种球病毒，不仅缩短了诱导培养周期，还具有脱毒率高，增值系数高等特点，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。
【专利说明】
一种百合种球脱毒方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物组培快繁技术和生物技术领域，具体涉及一种百合种球脱毒方 法。
【背景技术】
[0002] 百合是单子叶植物纲百合科(Li Iiaceae)百合属(Li Iium)的总称，为多年生宿根 草本花卉。百合属在世界上有90余种，原产我国的约有47种，占世界总数的51%。百合栽培 品种繁多，其花朵硕大，色彩丰富，花姿优美，既能作切花、盆花，又能在园林绿地中应用，且 大多数百合可以食用，是上等的滋补佳品。百合素有"百年好合"之意，深受人们的喜爱。百 合主要分布在中国、日本、北美和欧洲等温带地区，我国近年来的百合切花生产发展较快， 在昆明、上海、深圳已形成三大生产基地。但其繁殖主要还是采用常规分球、分珠芽鳞片扦 插，鳞片包埋等繁殖的方式。长期的无性繁殖使百合体内逐渐积累大量病毒致使百合患病 毒病，影响百合的产量和质量。
[0003] 在已报道的十余种侵染百合的病毒中，发生最为普遍，危害最为严重的病毒有3 种：黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV)、百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)，它们常表现为复合侵染，造成植 株的茎、叶或花出现斑驳或畸形，严重的导致植株矮小、退化甚至死亡，而且随着病毒的传 播，常导致百合大面积感病，严重影响了百合鲜切花的产量和品质。
[0004] 龙牙百合的产业化生产，种球繁殖是关键。在百合规模化种植中，我国百合种球繁 殖尚处于探索阶段，繁殖方法可分为有性繁殖(种子繁殖)和无性繁殖两种。其中有性繁殖 因为繁殖周期需要3-4年，因为多数百合杂种系不易结实，而且百合繁殖的后代容易发生变 异，不能完全保持原品种的优良性状，所以在实际生产中，百合较少用有性繁殖，而以无性 繁殖为主。其中无性繁殖主要采取的繁殖方式包括茎生小鳞茎繁殖、珠芽繁殖、鳞片扦插繁 殖和组织培养等。茎生小鳞茎繁殖获得的种球质量好，但繁殖系数低;珠芽繁殖形成商品球 的时间较长，一般要经过2-3年;鳞片扦插繁殖成本低、操作方便，且繁殖系数高，是快速繁 殖百合的有效方法。小鳞茎、珠芽、鳞片扦插的无性繁殖方法，均导致后代容易积累病毒，品 种退化现象十分严重。
[0005] 植物组织培养技术在以无性繁殖为主的植物上应用广泛，技术也相对成熟。采用 组织培养快繁龙牙百合，可在短时间内获得大量保持原有品种优良性状的优质种苗，如能 推行组织培养工厂化育苗，还能产生显著的经济效益。目前，针对龙牙百合组织培养快繁的 专利还未见报道，文献研究也主要集中在以获得种苗形式的组织培养上，对种球形式的组 织培养产品研究较少，对于生长于地下的龙牙百合鳞茎，带菌多，外植体消毒十分困难，存 在污染率较高的问题仍未得到较好的解决。
[0006] 百合病毒进行检测的方法主要有指示植物法、电镜检测法、血清学方法等，1990年 以来，国外逐渐开展了针对百合病毒的RT-PCR检测技术研究。RT-PCR技术用于百合病毒检 测在便捷性、灵敏度、特异性等方面均优于上述几种方法。而在传统RT-PCR基础上发展起来 的多重RT-PCR技术，因其快速、灵敏、特异性强、操作简单等优点(Bertolini et al.，2001; Nie and Singh，2001)，近年来在百合病毒检测方面得到了一定的研究。多重RTPCR又称复 RT-PCR，指将多对引物加入到一个反应体系中，同时扩增多个序列。应用该技术可以一次检 测多种病毒。
[0007] 目前国际上阻断病毒传播获得脱毒苗的基本方法有:茎尖培养、珠芽培养、化学处 理、热处理。
[0008] 因此建立简便易行、脱毒率高的脱毒体系是减少病毒对百合的危害、恢复种性的 关键问题之一。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种百合种 球脱毒方法。
[0010] 本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0011] -种百合种球脱毒方法，包括以下步骤：
[0012 ](1)将百合种球在3-8 °C放置40-50天；
[0013] (2)选取芽长为4-8cm的百合种球，剥去外层鳞片，留3-5个内层鳞片的鳞茎盘，将 鳞茎盘放入培养箱中进行预处理，预处理条件为:光照强度1500-2000LUX，温度35-40°C，处 理时间2-5天；
[0014] (3)选择预处理后生长正常的鳞茎盘，剥取0.4-0.7cm的茎尖移入分化培养基中， 先在23-25°C下暗培养1-2天，然后移入光照培养箱中，光照强度为1500-2000Lux，光照时间 为12-16小时/天，并以1-5 °C/天的速度升温，温度升至35-45°C后，保持该温度培养35-45 天。
[0015] 优选地，所述的分化培养基的配方为:MS培养基+6-BA1.2-1.8mg/L+NAA 0.35- 0 · 65mg/L+抗病毒剂 5_15mg/L。
[0016] 优选地，所述的抗病毒剂为二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中一种或多种的 混合物。
[0017] 更优选地，所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍混合而成，所 述二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍的质量比为（I-3): (1 -3): (1 -3)。
[0018] 具体的，在本发明中：
[0019] MS培养基的成份：
[0020] (1)大量元素：NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.90g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、MgS〇4 · 7H20 0 · 37g/L、CaCl2(2H20)0 · 44g/L;
[0021] (2)微量元素：MgS〇4 · 4H20 22.3mg/L、N3B03 6.2mg/L、ZnS〇4 · 7H208.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo〇4· 2H20 0.25g/L、CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L、CoCl · 6H2O 0.025mg/L、 FeS〇47H20 27 · 8mg/L、Na2-EDTA，37 · 3mg/L;
[0022] (3)有机成分:肌醇10〇11^凡、烟酸0.511^凡、1^-甘氨酸211^凡、维生素136 0.511^凡、维 生素 BI 0.1mg/L;
[0023] (4)蔗糖 3〇g/L;
[0024] (5)琼脂 12g/L。
[0025] 6-BA，即6-苄氨基腺嘌呤，CAS号：1214-39-7。
[0026] NAA，即 1-萘乙酸，CAS 号：86-87-3。
[0027] 二氢尿嘧啶，CAS 号：504-07-4。
[0028] 2-硫脲嘧啶，CAS 号：141-90-2。
[0029]盐酸吗啉胍，CAS 号：3160-91-6。
[0030]本发明百合种球脱毒方法，将热处理和化学处理结合脱除百合种球病毒，不仅缩 短了诱导培养周期，还具有脱毒率高，增值系数高等特点，为培育百合无病毒植株，推广无 毒化栽培的研究提供了技术基础。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0032] 实施例1
[0033] 百合种球脱毒方法，包括以下步骤：
[0034] (1)将百合种球（品种为西伯利亚，Siberia)在4°C放置45天；
[0035] (2)选取芽长为5cm的百合种球，剥去外层鳞片，留4个内层鳞片的鳞茎盘，将鳞茎 盘放入培养箱中进行预处理，预处理条件为:光照强度1600LUX，温度38°C，处理时间3天； [0036] (3)选择预处理后生长正常的鳞茎盘，剥取0.6cm的茎尖移入分化培养基中，先在 24°C下暗培养1天（即在24 °C黑暗无光的条件下放置1天），然后移入光照培养箱中，光照强 度为1500LUX，光照时间为12小时/天，移入培养箱中第1天温度为24°C，并以2°C/天的速度 升温，温度升至36 °C后，以36 °C培养35天。
[0037] 所述的分化培养基的配方为:MS培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+抗病毒剂 9mg/L〇
[0038] 所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍按质量比为1: 1:1混合而 成。
[0039] 实施例2
[0040]与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍 按质量比为1:1混合而成。
[0041 ] 实施例3
[0042] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、盐酸吗啉胍 按质量比为1:1混合而成。
[0043] 实施例4
[0044] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶 按质量比为1:1混合而成。
[0045] 实施例5
[0046] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于，所述步骤(3)为:选择生长正常的鳞茎盘，剥 取0.6cm的茎尖移入分化培养基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培养箱中，光照强度 为1500LUX，光照时间为12小时/天，并保持温度为24 °C培养30天。
[0047] 实施例6
[0048]与实施例1基本相同，区别仅仅在于，所述步骤（3)为:选择生长正常的鳞茎盘，剥 取0.6cm的茎尖移入分化培养基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培养箱中，光照强度 为1500Lux，光照时间为12小时/天，并保持温度为30 °C培养30天。
[0049] 实施例7
[0050] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于，所述步骤（3)为:选择生长正常的鳞茎盘，剥 取0.6cm的茎尖移入分化培养基中，先在24°C下放置1天，然后移入光照培养箱中，光照强度 为1500Lux，光照时间为12小时/天，并保持温度为36 °C培养30天。
[0051] 测试例1
[0052] 将实施例1-7中步骤(3)的茎尖在分化培养基中成活率进行统计。具体测试结果见 表1。
[0053] 表1:成活率结果表
L 〇〇55 J 比较实施例1和实施例2-4,实施例1(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍复配） 成活率明显高于实施例2-4(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中任意二者复配）。比较 实施例1与实施例5-7,实施例1(采用以2°C/天的速度升温)成活率明显高于于实施例2-4 (保持恒定温度）。
[0056] 测试例2
[0057]将实施例1-7中培养得到的茎尖脱毒率进行测试。
[0058]利用多重RT-PCR检测百合三种病毒（百合无症病毒、黄瓜花叶病毒、百合斑驳病 毒)具体参照陈进等发表在《农业生物技术学报》上的文献《百合三种主要病毒的RT-PCR检 测及脱毒技术研究》中的方法。脱毒率结果见表2。
[0059] 表2:三种病毒脱毒率结果表
[0062]比较实施例1和实施例2-4，实施例1 (二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍复配） 三种病毒脱毒率明显高于实施例2_4(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中任意二者复 配）。比较实施例1与实施例5-7,实施例1(采用以2°C/天的速度升温)三种病毒脱毒率明显 高于于实施例2-4(保持恒定温度）。
【主权项】
1. 一种百合种球脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将百合种球在3-8 °C放置40-50天； (2) 选取芽长为4-8cm的百合种球，剥去外层鳞片，留3-5个内层鳞片的鳞茎盘，将鳞茎 盘放入培养箱中进行预处理，预处理条件为:光照强度1500-2000LUX，温度35-40°C，处理时 间2-5天； (3) 选择预处理后生长正常的鳞茎盘，剥取0.4-0.7cm的茎尖移入分化培养基中，先在 23-25°C下暗培养1-2天，然后移入光照培养箱中，光照强度为1500-2000Lux，光照时间为 12-16小时/天，并以1-5 °C/天的速度升温，温度升至35-45 °C后，保持该温度培养35-45天。2. 如权利要求1所述的百合种球脱毒方法，其特征在于:所述的分化培养基的配方为： MS培养基+6-BA 1 · 2-1 · 8mg/L+NAA 0 · 35-0 · 65mg/L+抗病毒剂5-15mg/L。3. 如权利要求2所述的百合种球脱毒方法，其特征在于：所述的抗病毒剂为二氢尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中一种或多种的混合物。4. 如权利要求3所述的百合种球脱毒方法，其特征在于：所述的抗病毒剂由二氢尿嘧 啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍混合而成，所述二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍的质量比 为(1-3):(1-3):(1-3)〇
【文档编号】A01H4/00GK105941143SQ201610268132
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】邹声达, 邹先佼, 邹先佑, 张美凤, 吴杨, 李晓红, 胡雪华, 贺根和, 吴政元
【申请人】江西绿百合生态农业开发有限公司