通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法及其培养基的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法及其培养基。本发提供了一种用于获得灰毡毛忍冬再生植株的培养基，由下述质量份的营养成分组成：大量元素以NH4NO3计1650份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4·7H2O计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、玉米素0.1份?1.5份、吲哚丁酸0.1份?0.5份和蔗糖30000份。本发明所提供的用于获得灰毡毛忍冬再生植株的分化培养基针对性强，适用性好。本发明所提供的通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法，具有不受地区、气候与季节限制，便于大规模生产具有优良性状的单株。
【专利说明】
通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法及其培养基
技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法及其培养基。
技术背景
[0002]灰租毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)是忍冬科忍冬属多年生常绿缠绕或者直立小灌木植物。《中国药典》规定灰毡毛忍冬是山银花药材的主要植物来源之一，其花蕾的绿原酸含量很高，为常用入药部位。
[0003]以灰毡毛忍冬为种源形成的一系列品种，其花蕾数量众多、花蕾聚合成伞状或团状花序、花冠整齐、发育时期一致且花期集中、花朵几乎不开放、可一次性采摘，在生产上可大大节约采摘时间和劳动成本，产量显著高于金银花的植物来源，即以忍冬由来的品种，因此，随着对灰毡毛忍冬开发利用的不断扩展，对其数量和质量的要求也不断增强。
[0004]目前灰毡毛忍冬的繁殖多以无性繁殖如扦插繁殖为主，而不同品种植株性状变异较大，且扦插成活率低，不能满足市场需求;此外，通过分子育种手段培育灰毡毛忍冬优良品种，使其作为忍冬(金银花)的优良替代品，亦是亟待解决的问题。而通过组织培养的无性繁殖不但可以在短时间内实现种苗产业化，还为转基因技术提供了一定的基础。目前灰毡毛忍冬没有完善的再生体系，这些妨碍了对灰毡毛忍冬的进一步研究，特别是通过分子生物学的手段研究其高绿原酸含量、多花以及花蕾保持闭合状态等现象的机理研究。因此，目前需要研究并推广一套高效的灰毡毛忍冬的再生技术。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种用于获得灰毡毛忍冬再生植株的培养基。
[0006]本发明所提供的用于获得灰毡毛忍冬再生植株的培养基，是作为分化培养基，由下述质量份的营养成分组成:
[0007]大量元素以NH4NO3计1650份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4.7出0计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、玉米素0.1份-1.5份、B引噪丁酸0.1份-0.5份和蔗糖30000份；
[0008]所述大量元素由下述质量份的物质组成:
[0009]NH4NO3 1650份、KNO3 1900份、KH2PO4 170份、CaCl2.2出0 440份和MgSO4.7出0370份;
[0010]所述微量元素由下述质量份的物质组成:
[0011]KI 0.83份、Na2MoO4.2H20 0.25份、H3BO3 6.2份、CuSO4.5H20 0.025份、MnSO4.H2O 16.9份、(:0(:12*6!120 0.025份和ZnSO4.7出0 8.6份;
[0012]所述铁盐由下述质量份的物质组成:
[0013]Na2EDTA.2H20 27.8份和FeSO4.7H20 37.3份;
[0014]所述有机成分由下述质量份的物质组成:
[0015]烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆醇0.5份和甘氨酸2.0份。
[0016]所述培养基由以下成分组成:
[0017]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和水；
[0018]以上成分在所述培养基中浓度分别为:
[0019]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素0.lmg/L-1.5mg/L、卩引噪丁酸0.lmg/L-0.5mg/L、和鹿糖 30g/L。
[0020]本发明的另一个目的是提供一种用于获得灰毡毛忍冬再生植株的固体培养基。
[0021]本发明所提供的用于获得灰毡毛忍冬再生植株的固体培养基，是由凝固剂和上述用于获得灰毡毛忍冬再生植株的培养基配成的固体培养基。
[0022]所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为6g/L_8g/L;
[0023]所述凝固剂为琼脂。
[0024]所述培养基的pH值为5.8-6.2。
[0025]本发明的又一个目的是提供一种获得灰毡毛忍冬再生植株的方法。
[0026]本发明所提供的获得灰毡毛忍冬再生植株的方法，包括如下步骤:
[0027]将灰毡毛忍冬愈伤组织接种到所述用于获得灰毡毛忍冬再生植株的固体培养基上进行分化培养，得到灰毡毛忍冬再生芽；将所述灰毡毛忍冬再生芽接种到生根培养基上进行生根培养，即得到灰毡毛忍冬再生植株。
[0028]所述灰毡毛忍冬愈伤组织是通过包括如下步骤的方法得到的:
[0029]将灰毡毛忍冬外植体接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养，得到灰毡毛忍冬愈伤组织；
[0030]所述愈伤诱导培养基由以下成分组成:
[0031]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
[0032]以上成分在所述愈伤诱导培养基中浓度分别为:
[0033]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.011^凡、6-节基腺嘌呤011^凡-3.0mg/L、激动素Omg/L-1.5mg/L、玉米素0-1.5mg/L、卩引噪丁酸0.lmg/L-0.5mg/L、鹿糖30g/L和琼脂6g/L_8g/L;
[0034]所述诱导培养基的pH值为5.8-6.2。
[0035]所述生根培养基由以下成分组成:
[0036]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
[0037]以上成分在所述生根培养基中浓度分别为:
[0038]NH4NO3 0.825g/L、KN03 0.95g/L^KH2PO4 0.085g/L、CaCl2.2H20 0.22g/L、MgS〇4.7H20 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、卩引噪丁酸0.2mg/L_l.0mg/L、鹿糖10g/L和琼脂5g/L-8g/L;
[0039]所述生根培养基的pH值为5.8-6.2。
[0040]所述诱导培养是在温度为20°C_25°C、光强2000Lux-4000Lux、光周期为12小时光照/12小时黑暗、湿度为50%-70%的条件下培养15天-20天；
[0041 ] 所述分化培养基培养是在温度为20°C_25°C、光强2000Lux-4000Lux、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50%-70%的条件下培养15天-20天；
[0042]所述生根培养是在温度为20°C_25°C、光强2000Lux-4000Lux、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50 % -70 %的条件下培养20天-30天。
[0043]所述灰毡毛忍冬外植体为灰毡毛忍冬的新生嫩叶或灰毡毛忍冬新生茎段。
[0044]本发明所提供的用于获得灰毡毛忍冬再生植株的分化培养基针对性强，适用性好。本发明所提供的通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株的方法，具有不受地区，气候与季节限制，便于大规模生产具有优良性状的单株。灰毡毛忍冬目前没有可行的再生方法，鉴定灰毡毛忍冬中基因功能的途径往往要依赖于拟南芥或者烟草等模式植物来进行，很大程度上局限了其分子机理研究。灰毡毛忍冬组培再生技术为解决了这一问题提供了希望。
【附图说明】
[0045]图1为灰毡毛忍冬的再生过程，其中，A为灰毡毛忍冬新鲜嫩叶作为外植体经愈伤诱导培养得到的愈伤;B为灰毡毛忍冬愈伤开始分化;C为灰毡毛忍冬愈伤经分化培养得到的丛芽。
[0046]图2为丛芽经生根培养后的生根状况。
【具体实施方式】
[0047]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]实施例1、通过组织培养获得灰毡毛忍冬再生植株
[0050]方法I
[0051 ] 一、外植体消毒
[0052]取灰毡毛忍冬(公众可从中国科学院植物研究所获得，该材料引自湖南省隆回县并种植于中国科学院北京植物园三年以上；记载过该材料的非专利文献是:唐效蓉，李午平，彭晓锋(2005)，灰毡毛忍冬的组织培养与快速繁殖.植物生理学通讯41 (5)，642-642.)新生嫩叶为外植体，清水冲洗干净后，浸泡于流水悬冲lh，在无菌条件下，用无菌水冲洗I次，用70%的酒精消毒20s后再用2%的次氯酸钠溶液消毒4min，再转于1%的次氯酸钠溶液消毒4min，然后用无菌水冲洗3-5次，剪切成0.5cm3片状于无菌滤纸上吸干水分。
[0053]二、愈伤诱导培养
[0054]将步骤一灭菌后的叶片接种在愈伤诱导培养基上，在温度为25°C，光强2000LUX，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为50%的条件下培养20天，诱导出愈伤(图1中A)，中间可继代2-5次至形成膨大的愈伤(图1中B)。愈伤组织以紧致有小芽点较好。
[0055]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个外植体。
[0056]愈伤诱导率(%)=诱导形成愈伤数/接种外植体数X 100%。
[0057]结果:愈伤诱导率(％)为100 %。
[0058]所述诱导培养基由以下成分组成:
[0059]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0060]以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为:
[0061]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.111^凡、盐酸卩比卩多醇0.511^凡、甘氨酸2.011^凡、6-节基腺嘌呤2.011^凡、激动素111^凡、卩引噪丁酸0.lmg/L、鹿糖30g/L和琼脂7g/L;
[0062]所述诱导培养基的pH值为5.8。
[0063]三、分化培养
[0064]将步骤二得到的愈伤转接种于分化培养基中，在温度为25°C，光强2000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为50%的条件下培养20天，继代2-3次至分化形成芽长3?5cm的丛芽(图1中C)。
[0065]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个愈伤。
[0066]分化率(%)=分化形成丛芽数/接种愈伤数X 100%。
[0067]结果:分化率(％)为100 %。
[0068]所述分化培养基由以下成分组成:
[0069]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0070]以上成分在所述分化培养基中浓度分别为:
[0071]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素1.0mg/L、卩引噪丁酸0.lmg/L、鹿糖30g/L 和琼脂 7g/L;
[0072]所述分化培养基的pH值为5.8。
[0073]四、生根培养
[0074]将上述步骤三增殖培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为25°C，光强2000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为50%的条件下培养20天，至长出10?20条根(图2)。
[0075]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个丛芽。
[0076]生根率(%)=生根的丛芽数/接种的丛芽数。
[0077]结果:生根率为100 %。
[0078]所述生根培养基由以下成分组成:
[0079]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水；
[0080]以上成分在所述生根培养基中浓度分别为:
[0081]NH4NO3 0.825g/L、KN03 0.95g/L^KH2PO4 0.085g/L、CaCl2.2H20 0.22g/L、MgS〇4.7H20 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲噪丁酸0.2mg/L、鹿糖10g/L和琼脂5g/L;
[0082]所述生根培养基的pH值为5.8。
[0083]方法Π
[0084]一、外植体消毒
[0085]取灰毡毛忍冬新生茎段为外植体，清水冲洗干净后，在无菌条件下，用无菌水冲洗I次，用70%的酒精消毒30s后再用2%的次氯酸钠溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗3-5次，剪切成I?2cm不带腋芽的茎段于无菌滤纸上吸干水分。
[0086]二、愈伤诱导培养
[0087]将步骤一灭菌后的新生芽茎段接种在诱导培养基上，在温度为20°C，光强3000Lux，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为60%的条件下培养15天，中间可继代2-3次至诱导出愈伤。
[0088]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个外植体。
[0089]愈伤诱导率(%)=诱导形成愈伤数/接种外植体数X 100%。
[0090]结果:愈伤诱导率(％)为100 %。
[0091 ]所述诱导培养基由以下成分组成:
[0092]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖和水；
[0093]以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为:
[0094]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、6-节基腺嘌呤3.0mg/L、激动素1.0mg/L、口引噪丁酸0.2mg/L、鹿糖30g/L和琼脂7g/L;
[0095]所述诱导培养基的pH值为6.2。
[0096]三、分化培养
[0097]将步骤二得到的愈伤转接种于分化培养基中，在温度为20°C，光强3000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为60%的条件下培养20天，继代2-3次至分化形成丛芽。
[0098]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个愈伤。
[0099]分化率(%)=分化形成丛芽数/接种愈伤数X 100%。
[0100]结果:分化率(％)为100 %。
[0101 ]所述分化培养基由以下成分组成:
[0102]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0103]以上成分在所述分化培养基中浓度分别为:
[0104]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素0.lmg/L、卩引噪丁酸0.2mg/L、鹿糖30g/L 和琼脂 6g/L;
[0105]所述分化培养基的pH值为6.0。
[0106]四、生根培养
[0107]将上述步骤三分化培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为20°C，光强3000Lux，光周期为16小时光照/16小时黑暗，湿度为60%的条件下培养25天，至长出10?20条根。
[0108]实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设10个丛芽。
[0109]生根率(％)=生根的丛芽数/接种的丛芽数。
[0110]结果:生根率为100%。
[0111]所述生根培养基由以下成分组成:
[0112]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水。
[0113]以上成分在所述生根培养基中浓度分别为:
[0114]NH4NO3 0.825g/L、KN03 0.95g/L^KH2PO4 0.085g/L、CaCl2.2H20 0.22g/L、MgS〇4.7H20 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲噪丁酸0.5mg/L、鹿糖10g/L和琼脂5g/L;
[0115]所述生根培养基的pH值为5.8。
[0116]方法m
[0117]一、外植体消毒
[0118]取灰毡毛忍冬的新生叶片为外植体，浸泡流水悬冲2h后，在无菌条件下，用无菌水冲洗2次用2 %的次氯酸钠溶液消毒8min，然后用无菌水冲洗5次，剪切成0.5X0.5cm叶片于无菌滤纸上吸干水分。
[0119]二、愈伤诱导培养
[0120]将步骤一灭菌后的叶片接种在愈伤诱导培养基上，在温度为22°C，光强4000LUX，光周期为12小时光照/12小时黑暗，湿度为70%的条件下培养20天，中间可继代2-3次至诱导出愈伤。
[0121 ]所述诱导培养基由以下成分组成:
[0122]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0123]以上成分在所述诱导培养基中浓度分别为:
[0124]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素I.5mg/L、卩引噪丁酸0.5mg/L、鹿糖30g/L 和琼脂 7g/L;
[0125]所述诱导培养基的pH值为6.2。
[0126]三、分化培养
[0127]将步骤二得到的愈伤接种于分化培养基中，在温度为20°C，光强4000LUX，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为70%的条件下培养15天，继代2-3次至分化形成丛芽。
[0128]所述分化培养基由以下成分组成:
[0129]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0130]以上成分在所述分化培养基中浓度分别为:
[0131]NH4NO3 1.65g/L、KN03 I.90g/L、KH2P04 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H20
0.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸卩比卩多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素I.5mg/L、卩引噪丁酸0.5mg/L、鹿糖30g/L 和琼脂 8g/L;
[0132]所述分化培养基的pH值为6.2。
[0133]四、生根培养
[0134]将上述步骤三分化培养后的丛芽接种到生根培养基中，在温度为25°C，光强4000Lux，光周期为16小时光照/8小时黑暗，湿度为70%的条件下培养20-30天，至长出10?20条根。
[0135]所述生根培养基由以下成分组成:
[0136]NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.7H20、K1、Na2MoO4.2H20、H3BO3、CuS〇4.5H20、MnS04.H2O^CoCl2.6H20、ZnS04.7H20^Na2EDTA.2H20、FeS04.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、琼脂、蔗糖和水；
[0137]以上成分在所述生根培养基中浓度分别为:
[0138]NH4NO3 0.825g/L、KN03 0.95g/L^KH2PO4 0.085g/L、CaCl2.2H20 0.22g/L、MgS〇4.7H20 0.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS04.5H200.025mg/L、MnS04.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H20 27.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素
0.lmg/L、盐酸卩比哆醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、吲噪丁酸1.0mg/L、鹿糖10g/L和琼脂7g/L;
[0139]所述生根培养基的pH值为6.2。
【主权项】
1.一种用于获得灰毡毛忍冬再生植株的培养基，由下述质量份的营养成分组成: 大量元素以NH4NO3计1650份、微量元素以KI计0.83份、铁盐以FeSO4.7出0计37.3份、有机成分以烟酸计0.5份、玉米素0.1份-1.5份、B引噪丁酸0.1份-0.5份和蔗糖30000份； 所述大量元素由下述质量份的物质组成: NH4NO3 1650份、KNO3 1900份、KH2PO4 170份、CaCl2.2H20 440份和MgSO4.7H20 370份; 所述微量元素由下述质量份的物质组成: KI 0.83份、似2]?004 *2!120 0.25 份、H3BO3 6.2份、CuSO4.5H20 0.025 份、MnSO4.H2O16.9份、CoCl2.6H20 0.025份和21^04.7H20 8.6份; 所述铁盐由下述质量份的物质组成: Na2EDTA.2H20 27.8份和FeSO4.7H20 37.3份; 所述有机成分由下述质量份的物质组成: 烟酸0.5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆醇0.5份和甘氨酸2.0份。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于: 所述培养基由以下成分组成:NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.TH2O^KKNa2MoO4.2H20、H3BO3、CuS04.5H20、MnSO4.H2OXoCl2.6H2O,ZnSO4.7H20,Na2EDTA.2H20,FeSO4.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和水； 以上成分在所述培养基中浓度分别为: NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.90g/L^KH2PO4 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS04.7H200.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、MnSO4.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H2027.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸吡口多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、玉米素0.lmg/L-1.5mg/L、卩引噪丁酸0.lmg/L-0.5mg/L、和鹿糖30g/L。3.—种用于获得灰毡毛忍冬再生植株的固体培养基，是由凝固剂和权利要求1或2所述的培养基配成的固体培养基。4.根据权利要求3所述的固体培养基，其特征在于: 所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为6g/L-8g/L; 所述凝固剂为琼脂。5.根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于:所述培养基的pH值为5.8-6.2。6.—种获得灰毡毛忍冬再生植株的方法，包括如下步骤: 将灰毡毛忍冬愈伤组织接种到权利要求3-5中任一所述的培养基上进行分化培养，得到灰毡毛忍冬再生芽;将所述灰毡毛忍冬再生芽接种到生根培养基上进行生根培养，即得到灰毡毛忍冬再生植株。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于: 所述灰毡毛忍冬愈伤组织是通过包括如下步骤的方法得到的: 将灰毡毛忍冬外植体接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养，得到灰毡毛忍冬愈伤组织； 所述愈伤诱导培养基由以下成分组成:NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.TH2O^KKNa2MoO4.2H20、H3BO3、CuS04.5H20、MnSO4.H2OXoCl2.6H2O,ZnSO4.7H20,Na2EDTA.2H20,FeSO4.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、6-苄基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水； 以上成分在所述愈伤诱导培养基中浓度分别为: NH4NO3 1.65g/L、KN03 1.90g/L^KH2PO4 0.17g/L、CaCl2.2H20 0.44g/L、MgS04.7H200.37g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、MnSO4.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H2027.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸吡口多醇0.5mg/L、甘氨酸2.011^凡、6-节基腺嘌呤011^凡-3.0mg/L、激动素Omg/L-1.5mg/L、玉米素0-1.5mg/L、卩引噪丁酸0.lmg/L-0.5mg/L、鹿糖30g/L和琼脂6g/L-8g/L; 所述诱导培养基的pH值为5.8-6.2。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于: 所述生根培养基由以下成分组成:NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2.2H20^MgSO4.TH2O^KKNa2MoO4.2H20、H3BO3、CuS04.5H20、MnSO4.H2OXoCl2.6H2O,ZnSO4.7H20,Na2EDTA.2H20,FeSO4.7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、吲哚丁酸、蔗糖、琼脂和水； 以上成分在所述生根培养基中浓度分别为: NH4NO3 0.825g/L、KN03 0.95g/L、KH2P04 0.085g/L、CaCl2.2H20 0.22g/L、MgS04.7H200.185g/L、KI 0.83mg/L、Na2Mo04.2H20 0.25mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、MnS〇4.H2O 16.9mg/L、CoCl2.6H2O 0.025mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、Na2EDTA.2H2027.8mg/L,FeSO4.7H20 37.3mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素0.lmg/L、盐酸吡口多醇0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、卩引噪丁酸0.2mg/L_l.0mg/L、鹿糖 10g/L和琼脂5g/L_8g/L; 所述生根培养基的pH值为5.8-6.2。9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于: 所述诱导培养是在温度为20°C_25°C、光强2000Lux-4000Lux、光周期为12小时光照/12小时黑暗、湿度为50%-70%的条件下培养15天-20天； 所述分化培养基培养是在温度为20°C_25°C、光强2000Lux-4000Lux、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50%-70%的条件下培养15天-20天； 所述生根培养是在温度为20°C_25°C、光强2000LuX-4000LuX、光周期为16小时光照/8小时黑暗、湿度为50%-70%的条件下培养20天-30天。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述灰毡毛忍冬外植体为灰毡毛忍冬的新生嫩叶或灰毡毛忍冬新生茎段。
【文档编号】A01H4/00GK105918125SQ201610293043
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】王亮生, 吴杰, 苏上
【申请人】中国科学院植物研究所