亚油酰乙醇胺在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用
【专利摘要】本发明公开了亚油酰乙醇胺在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用以及在制备提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂中的应用。本发明以亚油酰乙醇胺为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的氧脂素代谢途径，可显著增强植物对黄化曲叶病毒病病害的抗性，减少因黄化曲叶病毒病给生产带来的经济损失。采用本发明制剂防治植物黄化曲叶病毒病简单易行，成本较低，可显著延迟和抑制黄化曲叶病毒在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对黄化曲叶病的抗性。
【专利说明】
亚油酰乙醇胺在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物化学保护技术领域，尤其涉及亚油酰乙醇胺在提高植物黄化曲叶 病毒病抗性中的应用。
【背景技术】
[0002] 由以番前黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV，简称TY)为代 表的多种双生病毒引起的番茄黄化曲叶病毒病是一种世界范围内流行，可造成毁灭性经济 损失的病毒病，也已成为全世界番茄生产的限制性因子。
[0003] 该病毒在烟粉虱和番茄植株内均能存活，自然条件下由烟粉虱传播，可以侵染茄 科多种植物。TYLCV染病番茄植株矮化，叶缘上卷，叶片边缘至叶脉区域黄化，结果数减少， 果实变小，成熟期果实着色不均，影响番茄品质，使其基本失去商品价值。
[0004] 迄今为止，尽管人们通过育种手段培育了一些抗性品种，但存在周期长，价格贵， 抗病品种只含有几个抗性基因，不能完全抗病等问题。所以，生产上对番茄黄化曲叶病毒病 及传毒媒介以化学防治为主。
[0005] 目前，防治病毒病主要使用菌克毒克、植病灵或吗啉胍?乙酮，但田间实际防效 差。防治烟粉虱主要使用吡虫啉、丁硫?吡虫啉、扑虱灵、氟虫腈等，但在病源众多和烟粉虱 虫口数量极大的情况下，喷杀虫剂对防治番茄黄化曲叶病毒病的效果往往不佳，且会有农 药残留的问题。因此，寻找一种高效无害的病害防治手段是今后农作物黄化曲叶病毒病防 治研究和发展的方向。
[0006]植物诱导抗病性是利用植物本身的防卫体系，借助于诱导因子激发植物整体抗性 水平，使原来的感病反应产生局部的或系统的抗性，提高抵抗病害的能力，又称获得性免 疫，是植物病害防治的一种新思路。
[0007] -般来说，植物通过诱导物产生系统抗病性，随后通过内源信号传递至整个植株， 产生一系列的生理生化反应，激活植物体内的抗病基因，产生一些具有抗病毒活性的物质。 植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间较长、可掌控的抗病性表达时间和空间等优点，其 中最重要的是目前发现的大部分诱导物对环境无污染，如能田间实际应用，将会在一定程 度上减少化学农药的使用，对降低农残，加快无毒农药取代有毒农药的进程，以及改善生态 环境和生态平衡都具有重要意义。
[0008] 脂类、多糖、核酸类、蛋白类物质均能够诱导寄主植物产生系统抗病性。目前我国 防治蔬菜病毒病的生物制剂有效成分主要包括香菇多糖、葡聚烯糖、低聚糖素、宁南霉素、 氨基寡糖素、苦参碱等，这些成分可以激发植株自身的防御系统，同时对某些病毒的复制和 扩散有一定的作用。但目前针对TYLCV进行防治的生物制剂的研究和应用还相对较少。
[0009] 亚油酰乙醇胺（英文名称:Linoleoylethanolamine;简称:LEA)，IUPAC名称为(9Z, 12Z)-N_( 2-hydroxy ethyl )octadeca_9,12-dienamide，分子式为C2QH37NO2，分子量为 323.5g/mol;其化学式为：
[0011] 亚油酰乙醇胺为植物天然存在的脂质生物活性化合物，为N-脂肪酰基乙醇胺⑴-acylethanolamines，NAEs)家族的成员。NAEs是一类脂肪酸与乙醇胺以酰胺键相连而成的 化合物。其在植物中的研究还相对较少，目前已知其参与了植物种子萌发及幼苗期的生长 发育的调节过程（B1 an caf lor 等 "N-Acyl ethanol amine s :lipid metabolites with functionsinplant growth and development /'The Plant Journal201479:568-583)，如 参与植物细胞防御系统中的信号转导，抑制信号转导系统中重要组分磷脂酶Da的活性，调 节种子萌发等。
【发明内容】
[0012] 本发明发现亚油酰乙醇胺能够诱导植物氧脂素(oxylipin)代谢途径，提高植物对 黄化曲叶病毒的抗性，降低黄化曲叶病毒病害的发生。
[0013] 基于以上发现，本发明还提供了亚油酰乙醇胺在制备提高植物黄化曲叶病毒病抗 性的制剂中的应用。
[0014] 亚油酰乙醇胺(LEA)为N-脂肪酰基乙醇胺(NAEs)中的一种，可诱导提高植物的氧 脂素代谢途径从而提高植物对黄化曲叶病毒病的抗性，降低TYLCV病毒在植物体内积累量 和病毒的长距尚运输。
[0015] 所述的植物具体可以为番茄。
[0016] 本发明还提供了一种提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂，该制剂，以1L计，包 括： 亚油酰乙醇胺 8~25g:; 表面活性剂 0,M).15U
[0017] 有机溶剂 0.15~0.5 L; 水 0_3 ~0.80L。
[0018] 所述的表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强， 有效减少制剂喷洒后随风漂移，提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、减少制剂的用量、延长 制剂的有效期。
[0019] 本发明中的表面活性剂可采用有机硅、吐温60或Silwet-L77中的一种，优选为有 机硅，有机硅表面活性剂价格更为低廉，且在提高本发明制剂的延展性、降低制剂表面张力 上效果更为显著，使制剂更易被植株吸收。
[0020] 所述有机溶剂的作用在于溶解亚油酰乙醇胺(LEA)，使LEA更易与其他组分混合， 本发明中的有机溶剂可采用乙醇或二甲基甲酰胺，更优选为乙醇。
[0021 ]进一步优选，所述的制剂，其特征在于，以1L计，包括： 亚油酰乙醇胺 16.18 g;
[0022] 表面活性剂 0 125L; 有机溶剂 0.325 L;
[0023] 水 0.55 L"
[0024] 在上述各组分配比下制得的制剂中，亚油酰乙醇胺(LEA)能够充分溶解于有机溶 剂中，且制剂在植物表面的分散性、展着性以及渗透性效果最佳。
[0025] 所述的制剂通过如下方法进行制备：
[0026] (1)将亚油酰乙醇胺先溶解于有机溶剂中，再加水，得到混合溶液；
[0027] (2)向混合溶液中加入表面活性剂，获得所述制剂。
[0028]在实际制剂配制中，亚油酰乙醇胺通常已溶解于有机溶剂中，作为原料直接使用。
[0029] 本发明还提供了一种提高植物黄化曲叶病毒病抗性的方法，包括:将所述的制剂 用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。
[0030] 本发明制剂可在连续强光、高温、干旱等易发番茄黄化曲叶病毒病的环境下或已 出现轻微黄化曲叶病毒病症状的时期进行使用。制剂的使用浓度、次数，尤其是制剂中亚油 酰乙醇胺的浓度可根据植物的苗龄、具体生长情况以及植物生长环境情况、病害程度来确 定。
[0031] 作为优选，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的亚油酰乙醇胺的浓度为 8.09_24.26mg/L。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033] (1)本发明对于已知化合物亚油酰乙醇胺发掘了新的提高植物黄化曲叶病毒病抗 性的用途，开拓了 一个新的应用领域。
[0034] (2)本发明制剂中的亚油酰乙醇胺，为植物源、环境友好型物质，可在环境和生物 体内降解，且长期使用该物质不会产生抗药性，使用后也无残留，对人畜和环境无毒害。 [0035] (3)本发明以亚油酰乙醇胺为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的氧 脂素代谢途径，可显著增强植物对黄化曲叶病毒病病害的抗性，减少因黄化曲叶病毒病给 生产带来的经济损失。
[0036] (4)采用本发明制剂防治植物黄化曲叶病毒病简单易行，成本较低，可显著延迟和 抑制黄化曲叶病毒在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对黄化曲叶病的抗性。
【附图说明】
[0037] 图1为实施例1中番茄黄化曲叶病毒接种后第7天、14天、21天后，喷施制剂与喷清 水对照间的番茄新叶中TYLCV相对DNA含量的比较；
[0038] 空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；
[0039] 小写字母a、b代表不同处理间在5%水平上的差异显著;nd表示未检测出TYLCV的 DNA〇
[0040] 图2为实施例2中喷施过制剂与喷清水对照的植株进行番茄黄化曲叶病毒接种处 理后，番茄叶片病害发生情况的比较；
[0041] A为番茄黄化曲叶病毒接种21天后病毒病发病率;B为番茄黄化曲叶病毒接种21天 后叶片内TYLCV相对DNA含量；
[0042] 空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；
[0043] 小写字母a、b代表不同处理间在5%水平上的差异显著。
[0044] 图3为实施例3中制剂的田间效应，喷施过制剂与喷清水对照的番茄病害发生率与 发生严重情况的比较；
[0045] A番茄黄化曲叶病毒病发生率;B喷施与未喷施本发明制剂后健康与发病番茄叶片 的净光合速率(Pn);
[0046] 空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；
[0047] 小写字母a、b、c代表不同处理间在5%水平上的差异显著。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0049] 实施例1
[0050] -、制剂的制备
[00511 取50mg/mL的亚油酰乙醇胺(LEA)的乙醇溶液32 · 3mL(药品购自SIGMA公司）；再缓 慢加入57.7mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入10.0 mL的有机硅溶液， 搅拌均匀后，获得制剂。
[0052]二、制剂的施用和检测
[0053]取上述制剂20毫升，加清水10升，混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为四叶一心 的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。
[0054]对上述处理植株用消毒竹签挑取农杆菌侵染性克隆菌体于番茄第1-2片真叶茎杆 处针刺接种番茄黄化曲叶病毒。将上述处理的所有植株置于28°C、70%湿度、12h光照/12h 黑暗、光强为400μιο1 π^?Γ1的环境下培养。
[0055] 于接种后第7天、14天、21天分别随机取上部幼嫩新叶，利用北京TIANGEN公司生产 的Plant Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取，后利用美国Applied Biosystems公司生产 的Step ONE Plus Real-Time PCR System仪器及该公司的SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂 盒对TYLCV的相对DNA表达量进行荧光定量qPCR的方法进行检测。采用的TYLCV特异引物为：
[0056] F:5 '-CTTCAAGGAATTCATGGGGG-3 '；R:5 '-GTCCCCAAGTAGTCTGTCTT-3 '。
[0057]结果如图1所示，上述制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的 TYLCV抗性。接种后第7天、14天、21天后，经制剂处理过的植株上部幼嫩叶片内的TYLCV病毒 DNA相对含量分别为对照植株的0%、21.8%和35.5%。
[0058] 实施例2
[0059] -、制剂的制备
[0060] 取50mg/mL的亚油酰乙醇胺（LEA)的乙醇溶液25.9mL(药品购自SIGMA公司）；再缓 慢加入61.6mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入12.5mL的有机硅溶液， 搅拌均匀后获得制剂。
[0061] 二、制剂的施用和检测
[0062]取上述制剂20毫升，加清水10升，混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为三叶一心 的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。
[0063]对上述处理植株用消毒竹签挑取农杆菌侵染性克隆菌体于番茄第1-2片真叶茎杆 处针刺接种番茄黄化曲叶病毒。将上述处理的所有植株置于32°C、70%湿度、12h光照/12h 黑暗、光强为400μιο1 π^?Γ1的环境下培养并观察植株发病情况。
[0064] 于接种后第21天，对番茄黄化曲叶病毒病发病率进行统计;并随机取上部幼嫩新 叶，利用北京TIANGEN公司生产的Plant Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取，后利用美国 Applied Biosystems公司生产的Step ONE Plus Real-Time PCR System仪器及该公司的 SYBR RT-PCR Kit荧光染料试剂盒对TYLCV的相对DNA表达量进行荧光定量qPCR的方法进行 检测。采用的TYLCV特异引物为：
[0065] F:5 '-CTTCAAGGAATTCATGGGGG-3 '，R:5 '-GTCCCCAAGTAGTCTGTCTT-3 '。
[0066] 结果如图2A和B所示:接种第21天后，在对照植株中，人工接种后TYLCV的发病率为 85 %，而上述制剂处理后的番茄黄化曲叶病毒病的发病率则下降55.3%，叶片TYLCV的相对 DNA表达量也比对照下降了59.4%。
[0067] 实施例3
[0068] -、制剂的制备
[0069] 取50mg/mL的亚油酰乙醇胺（LEA)的乙醇溶液42. lmL(药品购自SIGMA公司）；再缓 慢加入42.9mL的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入15mL的有机硅溶液，搅 拌均匀后，获得制剂。
[0070] 二、制剂的施用和检测
[0071] 选取栽培技术及管理完全一致的两个相邻的塑料大棚，在夏季高温少雨季节，对 处理棚使用上述制剂，取制剂40毫升，加清水20升，混合均匀后，在清晨和傍晚分两次均匀 喷施于苗龄为七叶一心的番茄叶片表面至叶片湿润为止，持续喷施2天;而对照棚仅喷施相 同体积的水。
[0072] 20天后随机统计处理棚与对照棚中各60株番茄的发病率，并通过光合作用参数比 较处理棚与对照棚植株的健康状况。光合作用速率采用美国Li-Cor公司生产的便携式光合 仪Li-6400测定净光合速率，叶片温度、光强和C02浓度分别设定为25°C、800ymol πΓΥΜθΟ μπιο? mol-1。
[0073]结果如图3所示:在番茄黄化曲叶病毒病高发阶段处理上述制剂20天后，明显增强 了番前植株对TYLCV的抗性，制剂处理的植株比对照植株的病株率下降了60%。处理植株与 对照植株中未发病健康植株的净光合速率(Pn)相似，制剂处理后仍然发病的植株也比对照 条件下发病植株的净光合速率(Pn)平均高66.0%。
【主权项】
1. 亚油酷乙醇胺在提高植物黄化曲叶病毒病抗性中的应用。2. 亚油酷乙醇胺在制备提高植物黄化曲叶病毒病抗性的制剂中的应用。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。4. 一种制剂，其据佈在干，Pi IL计，巧巧：5. 如权利要求16. -种提高植物黄化曲叶病毒病抗性的方法，其特征在于，包括:将权利要求4或5所述 的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的 亚油酷乙醇胺的浓度为8.09-24.26mg/L。
【文档编号】A01P1/00GK105900981SQ201610278298
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】师恺, 史军营, 邵淑君, 王娇, 吴爱芳, 喻景权
【申请人】浙江大学