中洋紫桐的培育方法
【专利摘要】本发明公开了中洋紫桐的培育方法，是以西洋紫桐为父本，梓树为母本进行杂交，F1代种子经过?7～?18℃冷藏120～160天后，取出保存，适时播种，F1代植株开花期喷洒秋水仙素水溶液，再进行人工授粉自交，种子成熟后采收，采下的F2代种子经?7～?18℃下冷藏处理120～160天；经过冷藏处理的F2代种子，或者经过冷藏处理的F2代种子播种生长的植株即为中洋紫桐。中洋紫桐与国内梓树相比形态差异较大，造型美观优雅，丰富了国内梓树品种。该品种生长速度快，耐盐碱、喜温暖，抗污染力强，耐寒，在东北寒地能过冬，具有较强的适应性，培育方法操作简单方便，可大规模生产推广，增加国内梓树品种多样化。
【专利说明】
中洋紫桐的培育方法
技术领域
[0001] 本发明涉及梓树繁育技术领域，特别涉及一种梓树新品种中洋紫桐的培育方法。
【背景技术】
[0002] 梓属(Catalpa)，紫葳科(Bignorriaceae)，乔木，全世界约13种，分布于美洲及亚 洲东部。我国包括引入种共5种及1变型（中国植物志编委会，2005)，包括楸树（Catalpa bungei C.A.Mey)、灰揪（Catalpa fargesii Bur?)、漬揪（Catalpa fargesii f.duclouxii (Dode)Gilmour)、藏揪（Catalpa tibetica)、黄金树（Catalpa speciosa)、梓树（Catalpa ovata G.Don. (《Flora of China》）），其中黄金树是引入种，滇楸是灰楸的变型（几种梓属 植物花粉形态及分类学意义，贾继文等，林业科学，2012年7月第48卷第7期：182~185)。梓 属树皮习称梓白皮，果实称梓实，均供药用，《本草纲目》记载具有清热、解毒、杀三虫和利尿 的功能。
[0003] 梓树(Catalpa ovata G.Don)又名大叶梧桐、假梧桐、梓白树、黄花楸、木角豆及豆工 豆树等。为落叶乔木，高达15~20m;树冠开展，树枝光滑稀疏有毛。树皮灰褐色，浅纵裂。单 叶对生，叶片阔卵形或近圆形，通常3~5浅裂，表面暗绿色，背面浅绿色。
[0004]梓树是集优质用材、名贵园林观赏、生态防护、药用等多种功能于一体，具有"木 王"与"材"貌双全之称的我国珍贵乡土树种。梓树不生虫，是最早利用其木材作为器具、建 筑、家具等上等材料的树种。梓树的果实、根皮或树皮的韧部(梓白皮)可以入药，其嫩叶可 食用。梓树原产我国东北、华北、华南北部，分布于长江流域及以北地区。
[0005] 国内的梓树品种单一，生长速度较慢。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种生长速度快，外观形态不同于国内梓树的新品种中洋紫 桐的培育方法，增加生物多样性，满足不同的观赏需求。
[0007] 本发明所述的中洋紫桐，是由西洋紫桐和国内的梓树杂交后自交并对自交子代在 形成种子时期就进行秋水仙素处理获得。
[0008] 西洋紫桐为美国引进的梓树新品种，原产地美国佛罗里达州，经过多年的试种，已 经在黑龙江、山东、北京等地种植，生长状态良好。2014年9月本专利的发明人将试种的植株 送至中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所鉴定为梓树，拉丁名Catalpa ovata，并命名 为西洋紫桐。
[0009] 西洋紫桐形态特征:落叶乔木，高达15米，树冠伞形，主干通直，树皮灰褐色，纵裂； 幼枝常带紫色，具稀疏柔毛。叶大对生或近于对生，有时轮生;叶片阔卵形，长宽近相等。叶 柄及叶脉为紫色，叶上端常有3~5小裂，叶背基部脉腋具3~6个紫色腺斑。先端渐尖，全缘 或渐波状，常3浅裂，两面均粗糙，微被柔毛或近无毛，基部掌状脉。顶生圆锥花序，花朵数量 多，花序梗微被疏毛，花冠淡黄色或黄白色，内有紫色斑点和2黄色条纹，长约2.5cm，直径约 2cm，能育雄蕊2,花丝插生于花冠筒上，退化雄蕊3;子房上位，棒形，柱头2裂。蒴果线形细长 如豇豆，经久不落。种子扁平，两端生有丝状毛丛。花期5~6月，果熟期8~9月。
[0010] 国内梓树(Catalpa ovata G.Don.)形态特征:落叶乔木，高达15~20米，树冠阔 广，枝条开展，树皮灰褐色，浅纵裂，幼枝及叶柄微毛，并有粘质。叶阔卵形或近圆形，常有3 ~5浅裂，先端突渐尖，基部浅心形，有毛，叶背基部脉腋有紫斑，顶生圆锥花序，有多数花， 花冠淡黄色或黄白色，内有黄色线纹及紫色斑点。蒴果细长如豇豆，长20~30cm，经久不落， 悬挂树上，种子两端有白色长毛。花期5~6月，果熟期9~11月。
[0011 ]本发明提供的中洋紫桐的培育方法，是以西洋紫桐(Cata 1 pa ovata)为父本，梓树 (Catalpa ovata G.Don.)为母本进行人工授粉杂交，种子成熟再采种，采下的Fi代种子经 过-7°C~_18°C冷藏120天~160天后，取出保存，适时播种，Fi代植株开花期喷洒秋水仙素 水溶液，再进行人工授粉自交，待种子成熟后采收，采下的^代种子经-7°C~_18°C下冷藏 120天~160天;经过冷藏的F 2代种子，或者经过冷藏处理的内代种子播种生长的植株即为中 洋紫桐代是指杂交或自交的子一代，F2代是指子二代。中洋紫桐的种子播种后生长开花 可以自交繁育，其生物学性状与亲本相同。
[0012] 中洋紫桐在形态上较为特别，幼苗期，叶子全缘无裂，先端渐尖，基部浅心形，叶柄 和叶脉紫色很深，新生幼叶呈紫红色;植株成年后叶形长宽近相等，绿色，3~5浅裂，叶柄和 叶脉依然为紫色但较幼苗期颜色浅;花序形态更接近西洋紫桐;花朵数量多，其中大部分为 黄色，白色较少。环境适应性好，生长速度快。
[0013] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，所述西洋紫桐为国外引进的梓 树新品种，叶柄和叶脉均为紫色，原产地为美国佛罗里达州，引种后通过扩增DNA条形码基 因，序列在CNBI blast和BOLD的结果为：PCR扩增ITS基因得到的序列与梓树（Catalpa ovata)序列相似度为100%，PCR扩增rbcL基因得到的序列与梓树(Catalpa ovata)序列相 似度为1〇〇%。
[0014] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，所述人工授粉的方法为戴上棉 线手套，蘸取父本的花粉后再蘸到母本雌蕊上，每天操作一次，重复3~5天。这种授粉方法 较为简单，无需特殊仪器设备，成本低。
[0015] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，所述秋水仙素水溶液中秋水仙 素与水的质量比为0.2~0.4:100.0。
[0016] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，分两次喷洒秋水仙素水溶液，两 次的间隔时间为2~3天。
[0017] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，作为父本的西洋紫桐树龄为三 年，杂交授粉时间在5~6月的花期，杂交后施肥和浇水，施肥量2.5kg/株。为保证花粉质量 最优，选择三年龄的西洋紫桐较好。施农家肥对土壤有修复作用，以鸡奠最好。
[0018] 作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，所述杂交和自交操作选择晴好 的天气，在早上6~8点之间，温度在20~25°C之间进行。
[0019]作为一种优选方案，上述中洋紫桐的培育方法中，所述播种的环境条件为温度28 ~32°(：，湿度85%以上。
[0020] 由以上任一所述的培育方法获得的中洋紫桐也在本发明的保护范围内。
[0021] 由以上任一所述的中洋紫桐作为亲本繁育获得的后代也在本发明的保护范围内。 所述的后代包括种子、植株以及其他可以生长繁育的生物组织。
[0022]本发明中洋紫桐的培育方法，具有以下有益效果：
[0023]本发明采用西洋紫桐作为父本，与国内梓树进行杂交，获得了新的梓树品种中洋 紫桐，与国内梓树相比形态差异较大，造型美观优雅，丰富了国内梓树品种。该品种生长速 度快，耐盐碱、喜温暖，抗污染力强，耐寒，在东北寒地能过冬，具有较强的适应性。
[0024]本发明的培育方法操作简单方便，不需要特殊仪器，对技术难度要求低，有利于大 规模生产推广，增加国内梓树品种多样化。
【附图说明】
[0025]图1是西洋紫桐的幼苗；
[0026]图2是西洋紫桐的花序；
[0027]图3是西洋紫桐的鉴定结果，A为基因ITS PCR扩增电泳图，B为基因rbcL PCR扩增 电泳图，样品1为茎，样品2为叶。
【具体实施方式】
[0028]为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和【具体实施方式】 对本发明作进一步的详细说明。
[0029]实施例1西洋紫桐的品种鉴定
[0030]西洋紫桐是
【申请人】迟桂杰在2009年通过中国检验检疫科学研究院引进的植物新 品种，原产地美国佛罗里达，供货商Park Seed公司。
[0031]西洋紫桐形态学特征如下：
[0032] 落叶乔木，高达15米，树冠伞形，主干通直，树皮灰褐色，纵裂;幼枝常带紫色，具稀 疏柔毛。叶大对生或近于对生，有时轮生；叶片阔卵形，长宽近相等，叶柄及叶脉为紫色，叶 上端常有3~5小裂，叶背基部脉腋具3~6个紫色腺斑。先端渐尖，全缘或浅波状，常3浅裂， 两面均粗糙，微被柔毛或近无毛，基部掌状脉。顶生圆锥花序，花朵数量多，花序梗微被疏 毛，花冠淡黄色或黄白色，内有紫色斑点和2黄色条纹，长约2.5cm，直径约2cm，能育雄蕊2， 花丝插生于花冠筒上，退化雄蕊3;子房上位，棒形，柱头2裂。蒴果线形细长如豇豆，经久不 落。种子扁平，两端生有丝状毛丛。花期5~6月，果熟期8~9月。
[0033] 引种成功后，将植株的叶片、根茎送往中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所 进行物种鉴定，使用分子生物学方法检测：通过DNA条形码基因进行检测额，所采用的基因 为ITS和rbcL。具体内容如下：
[0034] 一、实验所用仪器和试剂
[0035] 1、试剂
[0036] 表1
[0041] 二、试验流程
[0042] 1、基因组DNA提取；
[0043] 2、引物合成；
[0044] 3、PCR 扩增；
[0045] 4、电泳；
[0046] 5、测序；
[0047] 6、结果分析。
[0048] 三、实验步骤
[0049] 1、基因组DNA提取
[0050] ①取新鲜幼苗或叶片〇.14g放入研钵，液氮研成粉末后装入1.5mL离心管中。
[00511②加入65°C提前预热的"S"Buffer 650yL混合均匀后放入65°C水浴锅中温浴2h。 [0052] ③冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24:1)，轻摇15min，4°C离心10min (12000rpm/min)〇
[0053]④上清600yL转移至另一1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，轻柔混匀后4°C离心 10min(12000rpm/min)〇
[0054]⑤将上清液转移至另一离心管内，加入2/3体积预冷的异丙醇，-20°C放置30min，4 °C离心25min(12000rpm/min)，用灭菌牙签小心挑出絮状沉淀转入另一管中用70%乙醇洗 涤两次。
[0055] ⑥弃上清，干燥约30min溶于20iiL 1 X TE中。
[0056] ⑦加入 2yLRNase (10mg/ml)于 37。(：消化 2hr 〇
[0057] ⑧加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1)轻轻混匀于12000印111/1^11离心151^11。 [0058]⑨将上清转移到另一离心管中，加入等体积氯仿，轻柔混匀后12000rpm/min离心 15min〇
[0059]⑩上清液转移到另一离心管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，混匀后加入2倍 体积预冷的无水乙醇。
[0060] ⑩轻轻混勾，放置在_20°C30min，4°C离心25min( 12000rpm/min)，挑出沉淀用 70%乙醇洗涤两次干燥后加入100yL 1 XTE溶解，保存于-20°C备用。
[0061] @DNA质量检测及浓度测定：用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，根 据公式:DNA纯度= 0D26Q/0D28()(1.7-1.9为PCR级)DNA浓度(yg/mL) =50 X0D26Q测定核算的纯 度和浓度后，取适量样品用1 X TE稀释为50ng/yL保存备用。
[0062] 2、引物合成
[0063] 2.1基因 ITS
[0064] Primerl:5 '-atgtcaccacaaacagaaac-3 '；
[0065] Primer2:5 '-tcgcatgtacctgcagtagc-3 '。
[0066] 2.2基因洸乩
[0067] Primer3:5 '-atgtcaccacaaacagaaac-3 '；
[0068] Primer4:5 '-tcgcatgtacctgcagtagc-3 '。
[0069] 3、PCR 扩增
[0070] PCR反应的总体积为25yL，反应体系见表3。
[0071] 表3 PCR反应体系
[0073] 基因 ITS 反应条件为：先 94。(：，变性 7min;然后按 gATMSsecJOT^OsecJSrimin 进行循环，循环35次;最后在72°C，延伸7min。反应结束后，取3iiL PCR产物进行琼脂糖电泳。
[0074] 基因rbcL反应条件为：先94°C，变性lmin;然后按94°C30sec，53°C40sec，72°C 40sec进行循环，循环40次;最后在72°C，延伸5min。反应结束后，取3此PCR产物进行琼脂糖 电泳。
[0075] 4、琼脂糖电泳
[0076] 将TAE和电泳级琼脂糖按1.0% (W/V)配好，在微波炉中融化混匀，冷却至55°C左 右。加入SYBR:K:Green I核酸染料终浓度为0.5yg/mL，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插 上洋品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE(缓冲液没 过凝胶表面约1mm)。用适量的6 X加样缓冲液分别与3此样品混合，然后将DNA分子量标准物 分别加入到样品孔中。
[0077]接通电源使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迀移至足够分离DNA片段 时，关闭电源。将整个胶置于凝胶成像仪上观察。结果见图3。
[0078] 5、测序
[0079] ExoSAP-IT?酶(美国GENE公司）处理纯化PCR扩增产物，去除多余的dNTP和引物。 [0080] 5.1标准反应体系（20此，96孔板）：
[0081]表 4
[0083]测序PCR热循环条件：
[0084] gfCMmin-OeriOsec-SCrCSsec-eOtMmin) X25个循环-4°C保温。
[0085] 5.2测序产物纯化:20yL反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法
[0086] 1)每管加入2uL 125mM EDTA到管底，每管加入2uL 3M NaAc到管底。
[0087] 2)每管加入50yL 100%酒精，铝箱封严密，震荡混匀4次，室温放置15min。
[0088] 3) 1400-2000 X g离心45min或者2000-3000 X g离心30min，马上倒置96孔板，离心 至185Xg停止离心(从离心机启动到达到185Xg停止离心总共lmin时间）。
[0089] 4)每管加入70yL 70%酒精，1650Xg 4。(：离心15min;马上倒置96孔板，离心至185 X g停止离心(从离心机启动到达到185 X g停止离心总共lmin时间）。
[0090] 5)重复第4步1次。
[0091] 6)室温挥发净酒精，加入10yL Hi-Di Formamide溶解DNA;或者铝箱密封后于4°C 保存。
[0092] 6、结果分析
[0093] 对测得序列采用Sequence Analysis和DNASTAR软件进行校对和排序，然后与 GenBank中的现有数据库进行Blast比对和分类学比较，判断被测样品。
[0094] 待测样品序列在CNBI blast和BOLD的结果为:PCR扩增ITS基因得到的序列与梓树 (Catalpa ovata)序列相似度为100 %，PCR扩增rbcL基因得到的序列与梓树（Catalpa ovata)序列相似度为100%。
[0095]实施例2中洋紫桐的培育
[0096] 西洋紫桐(Catalpa ovata)种植:在6月下旬至7月中旬，暑伏初期播种即可，温度 28°C~32°C，湿度85 %。行距0.5m，株距7cm~10cm，每亩13000株~15000株，密植每亩可种 植40000株，下底肥，适时浇水除草松土。本地梓树与西洋紫桐间种。
[0097] 选择三年树龄的西洋紫桐为父本，梓树(Catalpa ovata G.Don.)为母本，进行杂 交育种。在5~6月的花期，选择晴好的天气，在早上6~8点之间，温度在20°C~25°C之间进 行人工授粉。方法为戴上棉线手套，蘸取父本的花粉后再蘸到母本雌蕊上，每天操作一次， 重复3~5天。人工授粉后施肥和浇水，施肥量2.5kg/株，农家肥尤其鸡粪最好。
[0098] 9月种子开始成熟，待种子成熟再采种⑴:代），存优去劣，留大穗，在_7°C~_18°C 冷藏120天~160天后，取出常温下保存。
[0099] 来年的6月下旬至7月上旬，把上述保存的？:代种子在温度28~32°C，湿度85 %适 时播种，3~5万株/亩，适时除草施肥浇水。
[0100] 转年进行移植，每亩1万株为宜，5~6月时自交培育F2代;具体方法为:开花后授粉 前，用100斤水配上约2~4两秋水仙素配制成秋水仙素水溶液，先喷一次，隔2~3天再喷一 次。人工授粉方法也是戴上棉线手套，将花粉蘸到雌蕊上，每天操作一次，重复3~5天，人工 授粉后施肥和浇水。等9月份~10月份采收，获得F 2代种子，继续低温冷藏，冷藏条件和上面 相同。经冷藏处理的^代种子即为中洋紫桐，再下一年气候适宜时即可播种获得中洋紫桐 植株。
[0101] 稳定性：中洋紫桐经多次反复繁殖后的子代特异性稳定，可以保持所有植株外观 特征。
[0102] 适宜种植的区域、环境及栽培技术：
[0103]适宜在长江流域及以北地区，东北南部、华北、西北、华中、西南等地区。中洋紫桐 适应性较强，耐盐碱，喜温暖，耐寒，也可生长于海拔500~2500米的低山河谷。土壤以深厚， 湿润，肥沃的夹砂土较好。抗污染力强，生长较快。
[0104] 表5形态特征差异
[0106] 实施例3生长速度比较
[0107]三块试验种植区（梓树、西洋紫桐、中洋紫桐)选在黑龙江省齐齐哈尔农垦分局繁 荣种畜场，2012年6月下旬至7月中旬播种，播种温度28~32°C，湿度85%，行距0.5m，株距 7cm~10cm，下底肥，适时饶水除草松土。
[0108] 2015年7月对种植生长情况现场查看，每株测量胸径，观测展叶状况，确定整株是 否死亡，枯枝枯死程度，对其生长状况进行评价。
[0109]表6梓树受冻害等级及判定标准
[0111]表7三块试验种植区梓树生长状况结果
[0113]
[0114] 中洋紫桐的抗冻能力非常强，在_30°C~_32°C的气候下过冬仍然无一株冻坏。
[0115] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 中洋紫桐的培育方法，其特征在于，以西洋紫桐（Catalpa ovata)为父本，梓树 (Catalpa ovata G.Don.)为母本进行人工授粉杂交，种子成熟再采种，采下的Fi代种子经 过-7°C~_18°C冷藏120天~160天后，取出保存，适时播种，Fi代植株开花期喷洒秋水仙素 水溶液，再进行人工授粉自交，待种子成熟后采收，采下的^代种子经-7°C~_18°C下冷藏 120天~160天;经过冷藏处理的内代种子，或者经过冷藏处理的内代种子播种生长的植株即 为中洋紫桐。2. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，所述西洋紫桐为国外引进 的梓树新品种，叶柄和叶脉均为紫色，原产地为美国佛罗里达，我国引种后通过扩增DNA条 形码基因，序列在CNBI blast和BOLD的结果为：PCR扩增ITS基因得到的序列与梓树 (Catalpa ovata)序列相似度为100%，PCR扩增rbcL基因得到的序列与梓树（Catalpa ovata)序列相似度为100%。3. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，所述人工授粉的方法为戴 上棉线手套，蘸取父本的花粉后再蘸到母本雌蕊上，每天操作一次，重复3~5天。4. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，所述秋水仙素水溶液中秋 水仙素与水的质量比为〇. 2~0.4:100.0。5. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，分两次喷洒秋水仙素水溶 液，两次的间隔时间为2~3天。6. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，作为父本的西洋紫桐树龄 为三年，杂交授粉时间在5~6月的花期，杂交后施肥和浇水，施肥量2.5kg/株。7. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，所述杂交和自交操作选择 晴好的天气，在早上6~8点之间，温度在20~25°C之间进行。8. 根据权利要求1所述的中洋紫桐的培育方法，其特征在于，所述播种的环境条件为温 度28~32°C，湿度85%以上。9. 由权利要求1~8任一所述的培育方法获得的中洋紫桐。10. 由权利要求9所述的中洋紫桐作为亲本繁育获得的后代。
【文档编号】A01H1/04GK105850719SQ201610269699
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】迟桂杰, 潘瑜
【申请人】迟桂杰