一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法，育种方法具体为：选取油菜花蕾，投入油菜单倍体诱导培养基中培养；对得到的小孢子进行暗培养，至得到子叶期胚状体；将子叶期胚状体经MS固体分化培养基、1/2MS生根培养基培养后，移入营养土中培养；将得到的单倍体植株，进行加倍处理，移入田地栽培；对得到的种子进行4代单株套袋自交，得到有稳定性状的双单倍体种子；暗培养后得到油菜幼芽；对油菜幼芽进行诱变处理，然后模拟日光培养，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入田地进行培养，进行连续6代单株套袋自交，即得。本发明采用的育种方法制种效率高，制种年限短，制种性状稳定且具有特殊性状。
【专利说明】
一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及油菜育种领域，具体涉及一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型 油菜育种方法。
【背景技术】
[0002] 油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一，是世界食用植物油和植物蛋白的主 要来源之一，在国际农产品贸易中占有重要地位。因此，油菜育种特别是优质油菜育种引起 了各国政府和科研工作者的高度重视。目前油菜的育种方式主要有杂交育种、诱变育种、双 单倍体育种、转基因技术等。
[0003] 目前杂交育种是广泛使用的油菜育种方法，需要数代子代培养，制种繁琐，制种产 量难以得到保证，且面临种子纯度问题，这也是影响杂交油菜增产潜力发挥的关键。转基因 技术通过基因工程手段将外源性有益目标基因片段嵌入到本物种可以表达的基因序列中， 从而得到具有一定优良效果的种子，由于引入了外源性因素，存在较大的潜在物种风险，并 且基因工程手段技术要求很高，一般难以实施。诱变育种使用各种理化以及生物方法促使 本物种基因发生突变，但诱变育种发生诱变后子代性状表现各异，难以掌控。双单倍体育种 是通过使用化学试剂使植物染色体组型加倍，选育性状优秀的子代的育种方法。因此联合 使用多种育种方法共同选育性状的子代种子是本发明专利的着眼之处和创新特征。
[0004] 中国专利CN201310368027.1公开了一种油菜的育种方法，包括步骤：以镇油5号提 纯复壮系为母本，以筛选出的远缘提纯复壮系为父本，采用人工去雄杂交，生产出杂交种 子。但是该专利的雄性不育系植株无法克服自花授粉和非目标父本的异花授粉，种子不纯 问题严重，造成产量连年下降，并且常规去雄杂交手术麻烦，收藏种子甚少，要通过多代加 繁种子，造成代数多严重退化的问题。
[0005] 中国专利CN200910044252.3公开了一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育系选育方法， 选择贵州野生油菜细胞质雄性不育单株作母本，保持系甘蓝型双低油菜819做父本，通过远 缘杂交、连续回交，得到甘蓝型油菜细胞质雄性不育系和保持系，繁殖该不育系，得到甘蓝 型细胞质雄性不育系贵野IIA不育系，将贵野IIA不育系测交，得到恢复系778。但是该专利 制得的雄性不育系的制种时间长，方法繁琐，会出现低温微粉从而导致杂交种出现不育株， 引起产量损失，容易产生种子赔付风险，而且制种繁琐，制种产量难以得到保证。
[0006] 因此急需提高制种效率，缩短制种年限，制种性状稳定，制种具有特殊性状的育种 方法。
【发明内容】
[0007] 本发明针对上述问题，提供一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种 方法，将育得的双单倍体进行化学诱变，产生高株高油性状的突变纯合子油菜植株，且大大 缩短了育种年限。
[0008] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：
[0009] -种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤S01，选取单核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用去菌水清洗2次~5次， 在1 °C~2°C的条件下，投入油菜单倍体诱导培养基中培养6h~8h，在350r/min~500r/min 的条件下进行离心分离，得到小孢子；
[0011] 步骤S02，将步骤SO 1得到的小孢子悬浮在单倍体诱导培养基中，在1°C~3°C的温 度条件下，暗培养4h~6h，至小孢子生长为胚状体时，在温度为30°C~35°C，转速为70r/min ~85r/min的条件下，调节单倍体诱导培养基的pH为6.3~6.8，进行暗培养，得到子叶期胚 状体；
[0012] 步骤S03,将步骤S02得到的子叶期胚状体接种至MS固体分化培养基，在28°C~32 °C的温度条件下，用150W~350W氙灯模拟日光进行培养，分化芽长出后接种至1/2MS生根培 养基，生根、炼苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株；
[0013] 步骤S04,将步骤S03中得到的单倍体植株进行优选，用浓度为150mg/L~300mg/L 的秋水仙碱对优选的单倍体植株的根系进行加倍处理，用流式细胞仪进行倍性分析，筛选 出双单倍体植株，移入田地进行正常栽培，得到双单倍体植株的种子；
[0014] 步骤S05,对步骤S04中得到的双单倍体植株的种子进行4代单株套袋自交，得到有 稳定性状的双单倍体种子，备用；
[0015] 步骤S06，对步骤S05中得到的有稳定性状的双单倍体种子在33 °C~36 °C的温度条 件下，在KM-8P培养基中进行暗培养20h~40h，至种子发芽，得到芽长为2cm~3.5cm的油菜 幼芽，备用；
[0016] 步骤S07，对步骤S06中得到的芽长为2cm~3.5cm的油菜幼芽，移入化学诱变培养 皿中进行诱变处理60h~96h，再转入1/2MS固体培养皿中，模拟日光培养至芽长为10cm~ 14cm的油菜幼苗，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入田地进行培养，保证无外来 花粉进入，与其他油菜种植田至少距离2km，进行连续6代单株套袋自交，即得稳定高株高油 性状的芥菜型油菜种子。
[0017]进一步地，步骤S01中，去菌水为：双氧水、二氧化氯、福尔马林、乙酸酐、无水乙醇 中的任一种。
[0018] 进一步地，步骤S01中，单倍体诱导培养基的成分及其浓度为:NH4N03、100mg/L~ 180mg/L，NH4CI、100mg/L ~150mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L ~400mg/L，KC1、200mg/L ~450mg/L， NaH2P〇4、150mg/L ~350mg/L，MgCl2、200mg/L ~350mg/L，CuCl2、80mg/L ~120mg/L，FeCl2、 lOOmg/L ~160mg/L，NaBH4、250mg/L ~500mg/L，Zn (N〇3) 2、180mg/L ~350mg/L，ZnCl2、150mg/ L~2 lOmg/L，麦芽糖、lOOOOmg/L~13000mg/L，糊精、12000mg/L~16000mg/L，琼脂、5000mg/ L ~lOOOOmg/L，谷氨酸、150mg/L ~200mg/L，苯丙氨酸、150mg/L ~200mg/L，脯氨酸、lOOmg/L ~150mg/L，维生素 K、20mg/L~80mg/L，异戊稀腺噪呤、15mg/L~30mg/L，磷酸吡咳胺、15mg/ L~70mg/L，生育三稀酸、25mg/L~100mg/L，硫胺素、30mg/L~90mg/L，烟酰胺、25mg/L~ 75mg/L，a_ 硫辛酸、40mg/L ~100mg/L。
[0019] 进一步地，步骤S02中，调节单倍体诱导培养基的pH为：采用浓度为0.15mol/L~ 0 · 30mol/L的HC1溶液和浓度为0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的Κ0Η溶液调节单倍体诱导培养基的 pH值。
[0020] 进一步地，步骤S03中，1/2MS生根培养基，还需添加2mg/L~5mg/L的IBA和lmg/L~ 2.511^/1^的2,40。
[0021]进一步地，步骤S03中，营养土的原料成分及其重量份为:石英砂50份~80份、碳化 娃25份~50份、高岭土35份~75份、石膏粉20份~45份、木肩45份~85份、白Μ土30份~60 份、丙酸钙50份~90份、硅胶颗粒25份~50份、麦麸麸皮70份~120份。
[0022] 进一步地，步骤S04中，加倍处理的时间为15h~30h。
[0023] 进一步地，步骤S07中，化学诱变培养皿的成分及其浓度为：丙烯酰胺80mg/L~ 120mg/L，氣胺苯醇 50mg/L ~140mg/L，硝基苯 60mg/L ~130mg/L，苯胺 65mg/L ~130mg/L，苯 基偶氮_2_萘酸70mg/L~140mg/L，3_甲基黄噪呤120mg/L~200mg/L，己内酰胺100mg/L~ 180mg/L，环磷酰胺90mg/L~170mg/L，二溴甘露醇140mg/L~230mg/L，环己亚硝脲130mg/L ~270mg/L，N_异丙基-(2-甲基肼基）120mg/L~200mg/L，双氯甲醚80mg/L~180mg/L，二甲 氨基偶氮苯85mg/L~200mg/L，氨基甲酸乙酯95mg/L~250mg/L，丁基轻甲苯85mg/L~ 170mg/L，哌磺氯苯酸 105mg/L ~240mg/L，硫脲啼啶 90mg/L ~180mg/L，6_ 疏基噪呤 100mg/L ~150mg/L，乙醇 2000mg/L ~4500mg/L。
[0024] 更进一步地，化学诱变培养皿的成分及其最佳浓度为:丙烯酰胺100mg/L，氯胺苯 醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘酸105mg/L，3-甲基黄噪呤160mg/L， 己内酰胺140mg/L，环磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇185mg/L，环己亚硝脲200mg/L，N-异丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，双氯甲醚130mg/L，二甲氨基偶氮苯145mg/L，氨基甲酸乙酯175mg/ L，丁基轻甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲啼啶135mg/L，6_疏基噪呤125mg/L，乙醇 3300mg/L〇
[0025] 进一步地，步骤S07中，模拟日光培养具体为:在温度28°C~33°C，光照强度20001x ~35001x的条件下，每天日照12h~14h。
[0026] 本发明的优点是：
[0027] 1.本发明采用单倍体育种与化学诱变育种联合育种，提高了育种的质量和育种的 效率，使得通过单倍体育种得到的油菜纯合体，在通过化学诱变得到有特殊性状的油菜种 子，且这种有特殊性状的油菜种子也是纯合体，有利于油菜种子优良性状的保持与传递；
[0028] 2.本发明采用的单倍体诱导培养基，富含多种无机盐、氨基酸以及各种糖类物质， 能够为小孢子萌发成胚状体提供必要的物质能量来源，补充植物生长发育过程中所必需的 各种微量兀素，提尚小抱子的发芽率；
[0029] 3.本发明采用的化学诱变培养基，由多种有机化合物复配而成，具有很强的生化 效果，能够有效的诱导油菜幼芽发生性状突变，有良好的化学诱变的效果。
【具体实施方式】
[0030] 以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的 多种不同方式实施。
[0031] 实施例1
[0032] -种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法 [0033] 包括以下步骤：
[0034]步骤S01，选取单核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用二氧化氯去菌水清洗2 次，在1°C的条件下，投入油菜单倍体诱导培养基中培养6h，在350r/min的条件下进行离心 分离，得到小孢子。其中单倍体诱导培养基的成分及其浓度为：NH4N03、lOOmg/L，NH4CI、 100mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L，KC1、200mg/L，NaH2P〇4、150mg/L，MgCl 2、200mg/L，C11CI2、80mg/ L，FeC 12、1 OOmg/L，NaBH4、250mg/L，Zn (N〇3) 2、180mg/L，ZnC 12、150mg/L，麦芽糖、1 OOOOmg/L， 糊精、12000mg/L，琼脂、5000mg/L，谷氨酸、150mg/L，苯丙氨酸、150mg/L，脯氨酸、100mg/L， 维生素 K、20mg/L，异戊烯腺嘌呤、15mg/L，磷酸吡哆胺、15mg/L，生育三烯酚、25mg/L，硫胺 素、30mg/L，烟酰胺、25mg/L，a-硫辛酸、40mg/L。
[0035]步骤S02,将步骤SOI得到的小孢子悬浮在单倍体诱导培养基中，在1°C的温度条件 下，暗培养4h，至小孢子生长为胚状体时，在温度为30 °C，转速为70r/min的条件下，采用浓 度为0.15mol/L的HC1溶液和浓度为0.15mol/L的Κ0Η溶液调节单倍体诱导培养基的pH为 6.3，进行暗培养，得到子叶期胚状体。
[0036]步骤S03,将步骤S02得到的子叶期胚状体接种至MS固体分化培养基，在28 °C的温 度条件下，用150W氙灯模拟日光进行培养，分化芽长出后接种至1/2MS生根培养基，生根、炼 苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株。其中1/2MS生根培养基中还需添加2mg/L的IBA和 lmg/L的2,4D。其中营养土的原料成分及其重量份为：石英砂50份、碳化硅25份、高岭土 35 份、石膏粉20份、木肩45份、白垩土30份、丙酸钙50份、硅胶颗粒25份、麦麸麸皮70份。
[0037]步骤S04,将步骤S03中得到的单倍体植株进行优选，用浓度为150mg/L的秋水仙碱 对优选的单倍体植株的根系进行加倍处理15h，用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出双单倍 体植株，移入田地进行正常栽培，得到双单倍体植株的种子。
[0038]步骤S05,对步骤S04中得到的双单倍体植株的种子进行4代单株套袋自交，得到有 稳定性状的双单倍体种子，备用。
[0039]步骤S06,对步骤S05中得到的有稳定性状的双单倍体种子在33 °C的温度条件下， 在KM-8P培养基中进行暗培养20h，至种子发芽，得到芽长为2cm的油菜幼芽，备用。
[0040]步骤S07,对步骤S06中得到的芽长为2cm的油菜幼芽，移入化学诱变培养皿中进行 诱变处理60h，再转入1/2MS固体培养皿中，在温度28°C，光照强度20001x的条件下，每天日 照12h，培养至芽长为10cm的油菜幼苗，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入田地 进行培养，保证无外来花粉进入，与其他油菜种植田距离2km，进行连续6代单株套袋自交， 即得稳定高株高油性状的芥菜型油菜种子。其中化学诱变培养皿的成分及其浓度为:丙烯 酰胺80mg/L，氯胺苯醇50mg/L，硝基苯60mg/L，苯胺65mg/L，苯基偶氮-2-萘酸70mg/L，3-甲 基黄噪呤120mg/L，己内酰胺100mg/L，环磷酰胺90mg/L，二溴甘露醇140mg/L，环己亚硝脲 130mg/L，N-异丙基-(2-甲基肼基）120mg/L，双氯甲醚80mg/L，二甲氨基偶氮苯85mg/L，氨基 甲酸乙酯95mg/L，丁基轻甲苯85mg/L，哌磺氯苯酸105mg/L，硫脲啼啶90mg/L，6-疏基噪呤 100mg/L，乙醇 2000mg/L。
[0041 ] 实施例2
[0042] -种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法
[0043] 包括以下步骤：
[0044]步骤S01，选取单核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用乙酸酐去菌水清洗5次， 在2°C的条件下，投入油菜单倍体诱导培养基中培养8h，在500r/min的条件下进行离心分 离，得到小孢子。其中单倍体诱导培养基的成分及其浓度为:NH4N03、180mg/L，NH4CI、150mg/ L，Ca(N03)2、400mg/L，KCl、450mg/L，NaH2P04、350mg/L，MgCl2、350mg/L，CuCl2、120mg/L， FeCh、160mg/L，NaBH4、500mg/L，Zn (N〇3) 2、350mg/L，ZnCl 2、21 Omg/L，麦芽糖、13000mg/L，糊 精、16000mg/L，琼脂、lOOOOmg/L，谷氨酸、200mg/L，苯丙氨酸、200mg/L，脯氨酸、150mg/L，维 生素 K、80mg/L，异戊稀腺噪呤、30mg/L，磷酸吡咳胺、70mg/L，生育三稀酸、100mg/L，硫胺素、 90mg/L，烟酰胺、75mg/L，a_ 硫辛酸、100mg/L。
[0045]步骤S02,将步骤SOI得到的小孢子悬浮在单倍体诱导培养基中，在3°C的温度条件 下，暗培养6h，至小孢子生长为胚状体时，在温度为35 °C，转速为85r/min的条件下，采用浓 度为0 · 30mol/L的HC1溶液和浓度为0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的Κ0Η溶液调节单倍体诱导培养 基的pH为6.8,进行暗培养，得到子叶期胚状体。
[0046]步骤S03,将步骤S02得到的子叶期胚状体接种至MS固体分化培养基，在32 °C的温 度条件下，用350W氙灯模拟日光进行培养，分化芽长出后接种至1/2MS生根培养基，生根、炼 苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株。其中1/2MS生根培养基中还需添加5mg/L的IBA和 2.5mg/L的2，4D。其中营养土的原料成分及其重量份为:石英砂50份~80份、碳化硅25份~ 50份、高岭土35份~75份、石膏粉20份~45份、木肩45份~85份、白垩土30份~60份、丙酸钙 50份~90份、硅胶颗粒50份、麦麸麸皮70份~120份。
[0047] 步骤S04,将步骤S03中得到的单倍体植株进行优选，用浓度为300mg/L的秋水仙碱 对优选的单倍体植株的根系进行加倍处理30h，用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出双单倍 体植株，移入田地进行正常栽培，得到双单倍体植株的种子。
[0048] 步骤S05,对步骤S04中得到的双单倍体植株的种子进行4代单株套袋自交，得到有 稳定性状的双单倍体种子，备用。
[0049]步骤S06,对步骤S05中得到的有稳定性状的双单倍体种子在36 °C的温度条件下， 在KM-8P培养基中进行暗培养40h，至种子发芽，得到芽长为3.5cm的油菜幼芽，备用。
[0050]步骤S07,对步骤S06中得到的芽长为3.5cm的油菜幼芽，移入化学诱变培养皿中进 行诱变处理60h~96h，再转入1/2MS固体培养皿中，在温度33°C，光照强度35001x的条件下， 每天日照14,培养至芽长为14cm的油菜幼苗，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入 田地进行培养，保证无外来花粉进入，与其他油菜种植田距离3km，进行连续6代单株套袋自 交，即得稳定高株高油性状的芥菜型油菜种子。其中化学诱变培养皿的成分及其浓度为:丙 稀酰胺120mg/L，氯胺苯醇140mg/L，硝基苯130mg/L，苯胺130mg/L，苯基偶氮-2-萘酸140mg/ L，3-甲基黄噪呤200mg/L，己内酰胺180mg/L，环磷酰胺170mg/L，二溴甘露醇230mg/L，环己 亚硝脲270mg/L，N-异丙基-(2-甲基肼基）200mg/L，双氯甲醚180mg/L，二甲氨基偶氮苯 200mg/L，氨基甲酸乙酯250mg/L，丁基轻甲苯170mg/L，哌磺氯苯酸240mg/L，硫脲啼啶 18〇11^凡，6-疏基噪呤15〇11^凡，乙醇450〇11^/匕 [0051 ] 实施例3
[0052] 一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法
[0053] 包括以下步骤：
[0054]步骤S01，选取单核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用无水乙醇去菌水清洗4 次，在1.5°C的条件下，投入油菜单倍体诱导培养基中培养7h，在430r/min的条件下进行离 心分离，得到小孢子。其中单倍体诱导培养基的成分及其浓度为:NH4N03、140mg/L，NH4C1、 125mg/L，Ca (N〇3) 2、300mg/L，KC1、325mg/L，NaH2P〇4、250mg/L，MgCh、275mg/L，CuCl 2、100mg/ L，FeCh、130mg/L，NaBH4、375mg/L，Zn (N〇3) 2、265mg/L，ZnCl2、180mg/L，麦芽糖、11500mg/L， 糊精、14000mg/L，琼脂、7500mg/L，谷氨酸、175mg/L，苯丙氨酸、175mg/L，脯氨酸、125mg/L， 维生素 K、50mg/L，异戊烯腺嘌呤、23mg/L，磷酸吡哆胺、45mg/L，生育三烯酚、65mg/L，硫胺 素、60mg/L，烟酰胺、50mg/L，a-硫辛酸、70mg/L。
[0055]步骤S02,将步骤SOI得到的小孢子悬浮在单倍体诱导培养基中，在2°C的温度条件 下，暗培养5h，至小孢子生长为胚状体时，在温度为32 °C，转速为78r/min的条件下，采用浓 度为0.23m〇VL的HC1溶液和浓度为0.23mol/L的Κ0Η溶液调节单倍体诱导培养基的pH为 6.5，进行暗培养，得到子叶期胚状体。
[0056]步骤S03,将步骤S02得到的子叶期胚状体接种至MS固体分化培养基，在30 °C的温 度条件下，用250W氙灯模拟日光进行培养，分化芽长出后接种至1/2MS生根培养基，生根、炼 苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株。其中1/2MS生根培养基中还需添加3.5m g//L的IBA 和1.8mg/L的2,4D。其中营养土的原料成分及其重量份为:石英砂65份、碳化硅38份、高岭土 55份、石膏粉33份、木肩65份、白垩土45份、丙酸钙70份、硅胶颗粒38份、麦麸麸皮95份。 [0057]步骤S04,将步骤S03中得到的单倍体植株进行优选，用浓度为225mg/L的秋水仙碱 对优选的单倍体植株的根系进行加倍处理23h，用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出双单倍 体植株，移入田地进行正常栽培，得到双单倍体植株的种子。
[0058]步骤S05,对步骤S04中得到的双单倍体植株的种子进行4代单株套袋自交，得到有 稳定性状的双单倍体种子，备用。
[0059]步骤S06,对步骤S05中得到的有稳定性状的双单倍体种子在35 °C的温度条件下， 在KM-8P培养基中进行暗培养30h，至种子发芽，得到芽长为2.8cm的油菜幼芽，备用。
[0060]步骤S07,对步骤S06中得到的芽长为2.8cm的油菜幼芽，移入化学诱变培养皿中进 行诱变处理78h，再转入1/2MS固体培养皿中，在温度31°C，光照强度27501x的条件下，每天 日照13h，培养至芽长为12cm的油菜幼苗，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入田 地进行培养，保证无外来花粉进入，与其他油菜种植田距离5km，进行连续6代单株套袋自 交，即得稳定高株高油性状的芥菜型油菜种子。其中化学诱变培养皿的成分及其浓度为:丙 稀酰胺l〇〇mg/L，氯胺苯醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘酸105mg/L， 3-甲基黄噪呤160mg/L，己内酰胺140mg/L，环磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇185mg/L，环己亚 硝脲200mg/L，N-异丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，双氯甲醚130mg/L，二甲氨基偶氮苯145mg/ L，氨基甲酸乙酯175mg/L，丁基轻甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲啼啶135mg/L，6_ 巯基嘌呤125mg/L，乙醇3300mg/L。
[0061 ] 实验例
[0062]对分别根据实施例1~3的育种方法制备的芥菜型油菜，标号为Y1、Y2、Y3，作为实 验组;对普通市售的芥菜型油菜，标记为Υ0,作为对照组。通过实验对实验组和对照组的育 种效果进行测试，测试结果见表1所示。
[0063]表1育种效果测试结果
[0064]
[0065] 结果：由对比结果可知，实施例1~3所育的芥菜型油菜植株与对照组芥菜型油菜 相比，其开花期长，植株高大，种子出油率提高，且耐受低温范围增大。
[0066] 结论:通过双单倍体及化学诱导联合育种方法获得的芥菜型油菜表现出开花时间 长、耐受低温能力优、株高长等特点，并且油菜种子出油率明显高于同类普通作物，具有较 高的经济价值和社会价值。
[0067] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种双单倍体及化学诱导联合作用的芥菜型油菜育种方法，其特征在于，包括以下 步骤： 步骤SOI，选取单核晚期或者二核期的芥菜型油菜花蕾，用去菌水清洗2次~5次，在1°C ~2°C的条件下，投入油菜单倍体诱导培养基中培养6h~8h，在350r/min~500r/min的条件 下进行离心分离，得到小孢子； 步骤S02，将步骤SO 1得到的小孢子悬浮在单倍体诱导培养基中，在1°C~3°C的温度条 件下，暗培养4h~6h，至小孢子生长为胚状体时，在温度为30°C~35°C，转速为70r/min~ 85r/min的条件下，调节单倍体诱导培养基的pH为6.3~6.8，进行暗培养，得到子叶期胚状 体； 步骤S03，将步骤S02得到的子叶期胚状体接种至MS固体分化培养基，在28°C~32°C的 温度条件下，用150W~350W氙灯模拟日光进行培养，分化芽长出后接种至1/2MS生根培养 基，生根、炼苗后移入营养土中培养，得到单倍体植株； 步骤S04，将步骤S03中得到的单倍体植株进行优选，用浓度为150mg//L~300mg//L的秋 水仙碱对优选的单倍体植株的根系进行加倍处理，用流式细胞仪进行倍性分析，筛选出双 单倍体植株，移入田地进行正常栽培，得到双单倍体植株的种子； 步骤S05,对步骤S04中得到的双单倍体植株的种子进行4代单株套袋自交，得到有稳定 性状的双单倍体种子，备用； 步骤S06,对步骤S05中得到的有稳定性状的双单倍体种子在33°C~36°C的温度条件 下，在KM-8P培养基中进行暗培养20h~40h，至种子发芽，得到芽长为2cm~3.5cm的油菜幼 芽，备用； 步骤S07,对步骤S06中得到的芽长为2cm~3.5cm的油菜幼芽，移入化学诱变培养皿中 进行诱变处理60h~96h，再转入1/2MS固体培养皿中，模拟日光培养至芽长为10cm~14cm的 油菜幼苗，筛选出有高株高油抗旱性状的油菜植株，移入田地进行培养，保证无外来花粉进 入，与其他油菜种植田至少距离2km，进行连续6代单株套袋自交，即得稳定高株高油性状的 芥菜型油菜种子。2. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S01中，所述去菌水为:双氧水、二 氧化氯、福尔马林、乙酸酐、无水乙醇中的任一种。3. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S01中，所述单倍体诱导培养基的 成分及其浓度为:NH4NO3、100mg/L ~180mg/L，NH4CI、100mg/L ~150mg/L，Ca (N〇3) 2、200mg/L ~400mg/L，KCl、200mg/L~450mg/L，NaH2P04、150mg/L~350mg/L，MgCl2、200mg/L~350mg/ L，CuCh、80mg/L ~120mg/L，FeCh、lOOmg/L ~160mg/L，NaBH4、250mg/L ~500mg/L，Zn (NO3 )2、 180mg/L~350mg/L，ZnCl2、150mg/L~210mg/L，麦芽糖、lOOOOmg/L~13000mg/L，糊精、 12000mg/L ~16000mg/L，琼脂、5000mg/L ~lOOOOmg/L，谷氛酸、150mg/L ~200mg/L，苯丙氛 酸、150mg/L ~200mg/L，脯氨酸、lOOmg/L ~150mg/L，维生素 K、20mg/L ~80mg/L，异戊稀腺噪 呤、15mg/L~30mg/L，磷酸吡咳胺、15mg/L~70mg/L，生育三稀酸、25mg/L~100mg/L，硫胺 素、30mg/L ~90mg/L，烟酰胺、25mg/L ~75mg/L，a_ 硫辛酸、40mg/L ~100mg/L。4. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S02中，所述调节单倍体诱导培养 基的pH为：米用浓度为0 · 15mol/L~0 · 30mol/L的HC1溶液和浓度为0 · 15mol/L~0 · 30mol/L 的K0H溶液调节单倍体诱导培养基的pH值。5. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S03中，所述1/2MS生根培养基，还 需添加2mg/L~5mg/L的 IBA 和 lmg/L~2.5mg/L的 2,4D。6. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S03中，所述营养土的原料成分及 其重量份为：石英砂50份~80份、碳化硅25份~50份、高岭土 35份~75份、石膏粉20份~45 份、木肩45份~85份、白垩土30份~60份、丙酸钙50份~90份、硅胶颗粒25份~50份、麦麸麸 皮70份~120份。7. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S04中，所述加倍处理的时间为 15h~30h。8. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S07中，所述化学诱变培养皿的成 分及其浓度为：丙稀酰胺80mg/L~120mg/L，氯胺苯醇50mg/L~140mg/L，硝基苯60mg/L~ 130mg/L，苯胺 65mg/L ~130mg/L，苯基偶氮-2-萘酸 70mg/L ~140mg/L，3_ 甲基黄噪呤 120mg/ L ~200mg/L，己内酰胺 100mg/L ~180mg/L，环磷酰胺 90mg/L ~170mg/L，二溴甘露醇 140mg/L ~230mg/L，环己亚硝脲130mg/L~270mg/L，N_异丙基-(2-甲基肼基）120mg/L~200mg/L，双 氯甲醚80mg/L~180mg/L，二甲氨基偶氮苯85mg/L~200mg/L，氨基甲酸乙酯95mg/L~ 250mg/L，丁基轻甲苯85mg/L~170mg/L，哌磺氯苯酸105mg/L~240mg/L，硫脲啼啶90mg/L~ 180mg/L，6_ 疏基噪吟 100mg/L ~150mg/L，乙醇2000mg/L ~4500mg/L。9. 根据权利要求8所述的育种方法，其特征在于，所述化学诱变培养皿的成分及其最佳 浓度为：丙稀酰胺l〇〇mg/L，氯胺苯醇95mg/L，硝基苯95mg/L，苯胺100mg/L，苯基偶氮-2-萘 酸105mg/L，3-甲基黄噪呤160mg/L，己内酰胺140mg/L，环磷酰胺130mg/L，二溴甘露醇 185mg/L，环己亚硝脲200mg/L，N_异丙基-(2-甲基肼基）160mg/L，双氯甲醚130mg/L，二甲氨 基偶氮苯145mg/L，氨基甲酸乙酯175mg/L，丁基轻甲苯130mg/L，哌磺氯苯酸175mg/L，硫脲 啼啶 135mg/L，6_ 疏基噪呤125mg/L，乙醇 3300mg/L。10. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤S07中，所述模拟日光培养具体 为:在温度28°C~33°C，光照强度20001x~35001x的条件下，每天日照12h~14h。
【文档编号】A01H4/00GK105830925SQ201610224821
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】周常
【申请人】周常