佛司可林的新用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种佛司可林(Forskolin)的新用途。
【背景技术】
[0002] 佛司可林是一种分离自印度植物Coleus forskohlii的天然二萜产物，通过激活 腺苷酸环化酶使细胞受体敏感化，提高cAMP在细胞内的水平。CREB (cAMP response element binding protein)作为真核生物中重要而又相当保守的转录调控因子，与cAMP 应答元件结合，调节被cAMP诱导的基因表达，产生多种多样的生理功能。我们的研究表明， 产滞育卵的家蚕中CREB的表达量比产非滞育卵的高。为此，我们利用腺苷酸环化酶的激活 剂佛司可林，在产非滞育卵的家蚕幼虫期注射，调查家蚕卵滞育性的改变和CREB表达量的 变化。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供佛司可林在制备诱导家蚕卵滞育药物中的应用。本发明内 容包括:用佛司可林注射非滞育的家蚕二化性品种(大造)有效诱导产出滞育卵的方法;佛 司可林作为腺苷酸环化酶的激活剂，激活了家蚕CREB的表达。本发明揭示了佛司可林可以 在幼虫阶段通过提高CREB的表达诱导家蚕卵的滞育性改变。
【附图说明】
[0004] 图1为注射后第二天家蚕脂肪中CREB表达量的变化。图A:western blot结果；图B: A图灰度分析结果，用CREB/Actin的相对比值表示。
【具体实施方式】
[0005] 本发明的具体步骤为： (1)滞育性家蚕与非滞育性家蚕 本发明利用二化性品种大造，该品种的蚕卵放在15°C、持续黑暗下孵化，为非滞育性家 蚕，化蛾后所产卵都为非滞育卵；而该品种的蚕卵放在25°C、持续光照下孵化，为滞育性家 蚕，化蛾后所产卵都为滞育卵。本发明利用15°C、持续黑暗下孵化的（大造)家蚕，其预定所 产卵都为非滞育卵。
[0006] (2)佛司可林试剂配制 佛司可林粉末为Sigma公司进口分装，放-20°C保存。使用前用二甲基亚砜(DMS0)溶解 配制成5 ug/uL储存液，再用蒸馏水稀释为0.02 ug/uL的工作液。
[0007] (3)佛司可林注射家香 非滞育性雌蚕五龄蜕皮后第二天放置冰上麻醉30分钟，用玻璃毛细管从家蚕腹足基部 注射佛司可林工作液(0.02 ug/uL)2uL，对照注射2%的DMS0 2 uL，用桑叶继续饲养，直至吐 丝结茧，化蛾后正常交配产卵。
[0008] (4)家蚕卵滞育性调查 家蚕交配产卵后放在25°C保存，10天后观察卵的孵化情况。若卵孵化则为非滞育卵，若 卵为褐色且未孵化则为滞育卵。调查结果见表1。
[0009] (5)家蚕CREB的检测 ① 解剖取样与蛋白质抽提 将注射后的家蚕桑叶饲养2天后，放置冰上麻醉30分钟后解剖取家蚕中肠和脂肪，加入 300 uL蛋白抽提液，用研磨器碾碎;冷冻离心机4°C、12000 rpm离心30min取上清； ② 上清蛋白质的定量 用Bradford法定量。标准曲线的制作:配制0.25、0.5、0.75、1、1.25、2 (mg/mL)浓度的 胎牛血清(BSA)作为标准溶液。在96孔板中各加入200 uL考马斯亮兰，分别再加入5 uL标准 蛋白样品和待测蛋白样品，室温黑暗中放置l〇min后，用酶标仪在595nm检测吸收值，制作标 准曲线计算样品蛋白浓度。
[0010] 蛋白上样样品的制备 用SDS-PAGE凝胶电泳的上样缓冲液(RSB )将抽提的蛋白稀释到浓度为4ug/uL，用100 °C 水煮沸5min后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品，置-20°C中保存备用。
[0011] _ SDS-PAGE凝胶电泳 1)胶的制备方法如下：1.0mm玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上，倒入 按下面方法配制的12%分离胶至离上端lcm处，再缓慢加入lml无菌水覆盖在胶上，静止 30min以上，待分离胶凝固。
[0012] 12%分离胶配制： ddH20 3.3ml 30% Arc-Bic溶液 4.0ml Tris Buffer(pH=8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% APS 0.1ml TEMED 4 μL 分离胶凝固后，倒去上面的水后，在分离胶上加入按下面方法配的5%浓缩胶至顶部， 插入1. Omm梳子，静置30min以上，待浓缩胶凝固后备用。
[0013] 5%浓缩胶配制： ddH2〇 4.1 mL 30% Arc-Bic溶液 1.0 mL Tris Buffer(ΡΗ=6·8) 0.75mL 10% SDS 60 uL 10% APS 60 uL TEMED 6 uL 2)上样与电泳:待浓缩胶凝固后，在电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，拔出梳子后上 样，上样量为20ug/泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳时间约3小时，至指示 剂溴酚兰至胶底边即停止电泳。
[0014] @转膜、抗体反应与发光 1) 先准备1张与胶大小一样的PVDF膜和两张滤纸； 2) PVDF膜先放入甲醇中浸15秒后，放入转膜缓冲液中平衡30min以上。
[0015] 3)胶从玻璃板上取下后，轻轻刮去浓缩胶，做好标记，在转膜缓冲液中平衡5min; 4)转膜:膜置于胶的上面，两面各放两层滤纸，夹好后按正负极放入转膜仪中，用100V 恒压，在低温下转膜75min。
[0016] 5)封闭液与封闭：用含0.5%吐温的缓冲液(PBST)配制成5%的脱脂奶粉溶液作为封 闭液，将转膜后的PVDF膜放在封闭液室温下封闭2小时； 6)抗体稀释:抗体用封闭液稀释到目的浓度，市售的CREB作为一抗； 7 )封闭后的PVDF膜用TOST清洗3次，每次1 Omin; 8)加入一抗，常温孵育2h后，用TOST洗4次，每次lOmin。
[0017] 9)加入二抗，常温孵育lh后，用PBST洗4次，每次lOmin;最后用PBS洗1次，15min。
[0018] 10)显色：用ECL试剂盒发光 ⑧感光记录与定量分析 用Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统成像；图像用Prism (GraphPad Software, San Diego, CA)对显影的蛋白条带进行定量分析。成像结果与定量分析结果见 说明书附图1。结果表明佛司可林可以有效地诱导家蚕脂肪中CREB表达量的增加（图A: Western blot结果;图B: A图灰度分析结果，用CREB/Actin的相对比值表示）。
【主权项】
1.佛司可林在制备诱导家蚕卵滞育药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种佛司可林（Forskolin）的新用途。本
【发明内容】
包括：用佛司可林注射非滞育的家蚕二化性品种（大造）有效诱导产出滞育卵的方法；佛司可林作为腺苷酸环化酶的激活剂，激活了家蚕CREB的表达。本发明揭示了佛司可林可以在幼虫阶段通过提高CREB的表达诱导家蚕卵的滞育性改变。
【IPC分类】A01K67/04
【公开号】CN105613437
【申请号】CN201511004325
【发明人】宋红生, 赵怡姣, 潮梦凌, 苑胜垒, 韩银银, 刘龙海
【申请人】上海大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月29日