一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术组织培养领域，具体涉及一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法。
【背景技术】
[0002]玉米(Zea mays L.)为禾本科玉米属一年生草本植物，也是重要的粮食、饲料和工业原料作物。根据《中国农村经济形势分析与预测(2013)》，2012年玉米总产量首次超过稻谷成为我国第一大粮食品种。玉米的组织培养研究是玉米生物技术育种的基础性工作，一直深受重视。相对于玉米幼胚，玉米成熟种子易于大量保存，不受生长季节和数量限制，可以随时取用，因此，成熟玉米种子是一种较理想的适用于玉米组织培养的外植体。玉米种子消毒是成熟胚组织培养的第一步，对玉米成熟胚组织培养的成功有重要影响。
[0003]现有的报道中，大部分玉米种子消毒实验中使用0.1%升汞(HgCl2)作为消毒剂(如项艳等，2007;贾秀萍等，2008;程莉等，2009 ;孔维萍，2010 ;裴冬丽等，2011;朴连玉等，2013)，也有使用0.2%升汞的报道(何婷等，2009)，上述报道所用的消毒剂具有不易去除，对组培材料的伤害较大，对环境有污染等缺点，而在玉米成熟胚培养中采用质量分数为2%次氯酸钠进行玉米种子消毒的方法却鲜有报道。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法。
[0005]本发明是这样实现的:
一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，包括如下步骤:
1)挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满的玉米种子备用；
2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为20-30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍，即可。
[0006]所述的步骤2)中自来水冲洗时间为10-30分钟，优选为20分钟。
[0007]所述的步骤2)中用质量分数为2%的次氯酸钠消毒时间为8-14分钟，优选为10分钟。
[0008]技术效果:本发明所述方法与现有的玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法采用的氯化汞相比，具有易去除，不留残毒，对组培材料的伤害较小，没有环境污染等优点。
【具体实施方式】
[0009]实施例1
I)采用平育2B玉米种子，挑选大小均匀、籽粒饱满的玉米种子分成五等份，分别装入50ml三角瓶中备用；
2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为I分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠将酒精漂洗后的玉米种子分别消毒，消毒的时间依次为4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用无菌水冲洗 3-5 遍，
然后分别在装有消毒处理后玉米种子的50ml三角瓶中，加入无菌水，以刚能浸没为准。将无菌水浸泡的消毒后的玉米种子放入培养箱中进行暗培养，温度设为26°C，每天观察种子生长情况，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，连续观察4天。
[0010]实验结论，用质量分数为2%次氯酸钠溶液处理平育2B玉米种子8分钟以上，玉米种子没有出现污染现象，消毒效果较好。
[0011]在超净工作台内，将无菌水浸泡72h的消毒后的玉米种子剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上，愈伤诱导培养基为MS培养基添加:Glu(L-谷氨酸)(300 mg/L) + CH (水解酪蛋白)(500 mg/L) + Pro (L-脯氨酸)(700 mg/L) +KT(激动素)(0.5 mg/L)+3%蔗糖+琼脂(7.5g/L)，2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)浓度为lmg/L，pH 5.8.在此基础上，在26°C智能光照培养箱中黑暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率为39.3%。
[0012]实施例2
1)采用郑单958玉米种子，挑选大小均匀、籽粒饱满的玉米种子分成五等份，分别装入50ml三角瓶中备用；
2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为I分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠将酒精漂洗后的玉米种子分别消毒，消毒的时间依次为4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用无菌水冲洗 3-5 遍，
然后分别在装有消毒处理后玉米种子的50ml三角瓶中，加入无菌水，以刚能浸没为准。将无菌水浸泡的消毒后的玉米种子放入培养箱中进行暗培养，温度设为26°C，每天观察种子生长情况，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，连续观察4天。
[0013]实验结论，用质量分数为2%次氯酸钠溶液处理郑单958玉米种子8分钟以上，玉米种子没有出现污染现象，消毒效果较好。
[0014]在超净工作台内，将无菌水浸泡72h的消毒以后的玉米种子剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上，愈伤诱导培养基为MS培养基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 琼脂(7.5g/L)，2，4-D浓度为2mg/L，pH 5.8.在此基础上，在26°C智能光照培养箱中黑暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率为44.4%。
[0015]实施例3
O采用神56玉米种子，挑选大小均匀、籽粒饱满的玉米种子分成五等份，分别装入50ml三角瓶中备用；
2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为I分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠将酒精漂洗后的玉米种子分别消毒，消毒的时间依次为4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用无菌水冲洗 3-5 遍，
然后分别在装有消毒处理后玉米种子的50ml三角瓶中，加入无菌水，以刚能浸没为准。将无菌水浸泡的消毒后的玉米种子放入培养箱中进行暗培养，温度设为26°C，每天观察种子生长情况，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，连续观察4天。
[0016]实验结论，用质量分数为2%次氯酸钠溶液处理神56玉米种子10分钟以上，玉米种子没有出现污染现象，消毒效果较好。
[0017]在超净工作台内，将无菌水浸泡72h的消毒后的玉米种子剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上，愈伤诱导培养基为MS培养基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 琼脂(7.5g/L)，2，4-D浓度为2mg/L，pH 5.8.在此基础上，在26°C智能光照培养箱中黑暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率为54.3%。
[0018]实施例4
O采用郑58玉米种子，挑选大小均匀、籽粒饱满的玉米种子分成五等份，分别装入50ml三角瓶中备用；
2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为I分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠将酒精漂洗后的玉米种子分别消毒，消毒的时间依次为4min、6 min、8 min、10 min、12min，最后用无菌水冲洗 3-5 遍，
然后分别在装有消毒处理后玉米种子的50ml三角瓶中，加入无菌水，以刚能浸没为准。将无菌水浸泡的消毒后的玉米种子放入培养箱中进行暗培养，温度设为26°C，每天观察种子生长情况，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，连续观察4天。
[0019]实验结论，用质量分数为2%次氯酸钠溶液处理郑58玉米种子10分钟以上，玉米种子没有出现污染现象，消毒效果较好。
[0020]在超净工作台内，将无菌水浸泡72h的消毒后的玉米种子剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上，愈伤诱导培养基为MS培养基添加:Glu (300 mg/L) + CH (500 mg/L) + Pro (700 mg/L)+KT (0.5 mg/L) +3% 蔗糖 + 琼脂(7.5g/L)，2，4-D浓度为lmg/L，pH 5.8.在此基础上，在26°C智能光照培养箱中黑暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率为60%。
【主权项】
1.一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于: 包括如下步骤: 1)挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满的玉米种子备用； 2)取步骤I)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为20-30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75%酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2%的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍，即可。2.根据权利要求1所述的一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于:步骤2)中自来水冲洗时间为10-30分钟，优选为20分钟。3.根据权利要求1所述的一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于:步骤2)中用质量分数为2%的次氯酸钠消毒时间为8-14分钟，优选为10分钟。
【专利摘要】本发明涉及一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法。包括如下步骤：1)挑选玉米种子备用；2)取步骤1)挑选的玉米种子冲洗，冲洗时间为20-30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75％酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2％的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍。本发明所述方法与现有的玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法采用的氯化汞相比，具有易去除，不留残毒，对组培材料的伤害较小，没有环境污染等优点。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105580731
【申请号】CN201410560780
【发明人】王洪振
【申请人】吉林师范大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月21日