一种露地菊‘火焰’间接体细胞胚快速诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种露地菊新品种的间接体细胞胚快速诱导方法。
【背景技术】
[0002]植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)在植物组织培养中是一种非常普遍的现象，指单倍体或双倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。植物体细胞胚胎发生的形式有两种:一种是从外植体上直接发生，不经过愈伤组织，即直接体细胞胚发生；二是经过愈伤组织阶段再分化为体胚，即间接体细胞胚发生。许多研究表明，植物体细胞胚的形成多通过间接途径产生，在愈伤组织中，某些体细胞可以转化为胚性细胞，胚性细胞通过再分裂形成多细胞原胚，以及不同发育时期的体细胞胚，从而获得数量更多、再生率更高的体细胞胚和再生植株。
[0003]露地菊Chrysanthemum)是一类新型菊花品种群，同以往的菊花类型截然不同，其显著的特点是植株低矮，覆盖力强，繁殖容易，管理粗放，适应范围广，抗逆性强，抗病虫害能力强，花色丰富，花多而密，花期长。露地菊的这些突出优点使它被广泛的应用于公园、街道绿地、城市道路绿化带等地方。由于露地菊适应性强，观赏价值高，深受人们喜爱，在我国东北地区秋季绿化所用的露地花卉中，露地菊占有很大的比重。露地菊‘火焰’是近年来新育成的露地菊新品种，目前在东北地区的绿化市场中需求量很大。
【发明内容】
[0004]本发明目的是为了建立一种露地菊‘火焰’间接体细胞胚快速诱导方法，通过诱导体细胞胚产生植株，不仅速度快，数量多，结构完整，无需进行根的诱导，更重要的是不易产生变异，无病毒污染，能保持母本的优良性状。
[0005]在目前露地菊栽培生产过程中，扦插育苗和移栽作业需要花费大量的人力和物力，在生产成本中占有相当大比重，并且在扦插繁殖的情况下，病毒不可避免的会侵染植株，严重影响露地菊的商品品质，这也是使生产效益下降的原因。通过本发明把诱导出的露地菊体细胞胚用于生产种苗，不仅繁殖率高，而且在繁殖过程中出现变异的危险性少，并且无病毒污染，尤其是可以把体细胞胚制作成人工种子直接栽种于大田，就能实现高度省力、低成本的栽培。
[0006]由于露地菊遗传背景十分复杂，基因型高度杂合，常规育种往往受到染色体的多倍性和非整倍性的影响，带来自交不亲和性、种子生产效率低等问题。此外，露地菊常规育种存在着无法利用其它物种基因资源的局限性。在目前露地菊新品种选育特别是抗性培育方面，利用转基因技术可以克服以上种种不利条件。而成功的基因转化首先依赖于良好的受体系统的建立，本发明所建立的露地菊间接体细胞胚诱导途径再生系统是最理想的基因转化受体系统。
【附图说明】
[0007]图1为露地菊‘火焰’间接体细胞胚前期诱导培养效果；图2为露地菊‘火焰’间接体细胞胚后期诱导培养效果。
【具体实施方式】
[0008]露地菊‘火焰’间接体细胞胚诱导方法按以下步骤进行:
[0009](一 )露地菊‘火焰’莖尖脱毒
[0010]挖取苗圃地种植的露地菊‘火焰’基部萌发的健壮脚芽，去掉长于3mm叶片，流水冲洗30min，用0.1?0.2%的Tween20浸泡5min，之后再流水冲洗30min左右，于超净工作台75%乙醇表面杀菌20s，无菌蒸馏水冲洗3?4遍，用1%有效成份的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌蒸馏水冲洗3遍，在无菌滤纸上吸干表面水分，剥除外边叶片，把茎尖接种于培养基一中，诱导茎尖顶芽萌发获得无菌苗。
[0011]( 二 )间接体细胞胚前期诱导培养
[0012]取无菌苗中上部幼嫩叶片，分割成约lcmX lcm大小块，正面向上接种于培养基二上，接种时用镊子轻微按压叶片四周边缘，使其充分接触培养基，在黑暗环境培养15d。
[0013](三)间接体细胞胚后期诱导培养
[0014]把暗培养15d后的叶片接种于培养基三上，此时的叶片边缘淡黄绿色愈伤组织肉眼可见，继续在黑暗环境培养，15d后在叶片的边缘即可获得大量露地菊‘火焰’体细胞胚。
[0015]以上接种工作均需在超净工作台中进行，所用器械需提前高温灭菌烘干备用，培养条件为25 °C恒温无菌环境。
[0016]培养基一:1/2MS
[0017]培养基二:MS+0.5mg/L6-BA+l.5mg/L NAA+0.75mg/L2, 4_D
[0018]培养基三:MS+0.5mg/L6-BA+l.5mg/L NAA
[0019]每升培养基含蔗糖30g，琼脂8g，PH = 5.78。
【主权项】
1.露地菊‘火焰’茎尖经表面灭菌后接种在脱毒培养基上，脱毒培养基配方:1/2MS。2.以露地菊‘火焰’无菌苗的叶片为外植体，接种于间接体细胞胚前期诱导培养基上，于黑暗环境培养15d，前期诱导培养基配方:MS+0.5mg/L6-BA+l.5mg/L NAA+0.75mg/L2, 4-D。3.把经过前期诱导培养后的叶片接种于间接体细胞胚后期诱导培养基上，于黑暗环境继续培养15d，后期诱导培养基配方:MS+0.5mg/L6-BA+l.5mg/L NAA ； 每升培养基添加蔗糖30g，琼脂8g，PH = 5.78。
【专利摘要】露地菊‘火焰’间接体细胞胚快速诱导方法，属于细胞工程技术领域。本发明利用植物组织培养的方法，通过二次诱导，获得大量露地菊‘火焰’体细胞胚，不仅速度快，数量多，结构完整，更重要的是不易产生变异，无病毒污染，能保持母本的优良性状。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105309304
【申请号】CN201410332223
【发明人】王江, 张旸, 解莉楠, 丁兵, 王宇, 李玉花
【申请人】东北林业大学, 李玉花, 张旸
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月14日