一种培育广谱、持久穗瘟抗性水稻育种材料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水稻分子育种技术领域，涉及一种培育广谱、持久穗瘟抗性水稻育种 材料的方法。
【背景技术】
[0002] 由真菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是水稻最严重病害之一，严重威胁着水 稻的持续高产和稳产。据统计，全球每年因稻瘟病造成的产量损失达10% -30%，直接经 济损失约50亿美元，损失的粮食足以养活6000万人。在我国，稻瘟病每年都有不同程度 的发生，特别是近几年，在西南、长江中下游和东北等稻作区持续大发生，年发病面积达330 万~570万ha，损失稻谷数亿公斤，给我国水稻安全生产带来了巨大隐患。实践证明，利用 抗病基因培育抗性品种是最为经济有效的病害控制措施之一。但是由于稻瘟病菌的致病性 分化严重，生理小种多，变异频繁，给抗病品种的选育带来了困难，含有单个抗病基因的抗 病品种往往推广种植3-5年便"丧失"抗病性而成为感病品种。因此，聚合几个/多个抗性 基因，一直被认为是培育广谱、持久抗性品种的另一个有效途径。而对于不同稻瘟病基因的 聚合效应，研宄结果并不一致。如陈红旗等（2008)、Jiangetal(2012)和Fuetal(2012) 分别报道聚合Pil/Pi2/Pi33三基因、Pil/Pi2/D12三基因、Pil/Pi2两基因的品系对中国 南方稻区稻瘟病菌株具有广谱抗性。而IRRI以C〇39为背景，构建了分别携带PiUPiz5和 Pita的单基因系，以及分别携带2-3个抗性基因的聚合系，鉴定结果显示虽然多基因聚合 系一般具有较强的抗性，但Piz5和Pita的抗性基因聚合系抗性反而不如单基因抗性品系 (Hittalmanietal, 2000);同样的一套材料在中国的鉴定试验中也发现Pil和Pita的聚 合系不如单基因抗性品系（何月秋等，2001)。
[0003] 稻瘟病的发生，根据其发生时期及部位，可分为苗瘟以及成株期的叶瘟、节瘟、穗 瘟、谷粒瘟等，其中以苗瘟及穗瘟等最为常见。苗瘟抗性接种鉴定，由于具有操作简便、流程 易标准化、易实现针对大规模的遗传分析群体的鉴定等优点，而得以广泛应用。目前，已经 定位或克隆的稻瘟病抗性基因，绝大多数是利用苗瘟鉴定方法鉴别的。上述提到的Pil、Pi2 与Pi33、D12,以及PiUPiz5和Pita的多基因聚合效应，也主要是针对苗瘟抗性而言的。而 穗瘟，对水稻生产的危害程度要显著高于苗瘟、叶瘟等，但是由于穗瘟的接种鉴定存在误差 大、流程难以标准化、接种工作量大等缺陷，一直很难大规模开展应用，针对不同基因/基 因聚合的穗瘟抗性效应分析，因而也就非常缺乏。
[0004] 近年来，随着分子生物学的发展，水稻基因组测序的完成，越来越多的稻瘟病抗性 基因被定位，目前已经鉴定了 80多个稻瘟病抗性基因，其中有超过20多个抗病基因被克 隆。我们利用已克隆的稻瘟病抗性基因功能性及紧密连锁分子标记对我国目前生产上的育 种主体亲本进行基因型检测，结合苗瘟抗性鉴定结果，通过多元回归模型及相关性分析初 步明确了位于水稻第6染色体短臂的Pigm与位于第11染色体长臂的Pi54具有良好的苗 瘟抗性互补性。
[0005] Pigm位于水稻第6染色体短臂，与Pi2、Pi9等广谱稻瘟病抗性基因等位或紧密连 锁，其对中国南方稻区不同菌株具有良好的苗瘟抗性（Dengetal，2006)。Pi54位于第11 染色体长臂，是Pik基因簇中的NBS-LRR成员之一，并对印度的不同稻瘟病菌株具有良好的 苗瘟抗性（Sharmaetal，2005;Ramkumaretal，2011)。，但目前尚未有研宄报道这两个基 因聚合后是否具备穗瘟抗性效应。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗穗瘟水稻育种材料的培育方法。通过回交、分子标 记辅助选择、农艺性状评价及抗性鉴定等方法创制抗穗瘟的水稻育种材料。为了实现本发 明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种培育广谱、持久穗瘟抗性育种材料的方法，其特征包含以下具体步骤：
[0008] (1)轮回亲本分别与抗性基因供体谷梅4号和K3杂交，获得杂交F1R，分别以 F1-PignuF1-PiSA表示；其中谷梅4号携带的抗性基因为Pigm，K3携带的抗性基因为Pi54 ;
[0009] ⑵种植F1-Pigm和F「Pi54种子，开花期分别与轮回亲本回交得到回交1代，分 别以BC1F1-Pigm和BC1F1-PiSA表示；
[0010] ⑶种植BC1F1-PignuBC1F1-PiSd种子，在苗期提取各BC1F1分离群体中单株DNA， 并利用与目标基因紧密连锁的分子标记进行PCR检测，选择含有Pigm和Pi54基因且农艺 性状和轮回亲本相似的杂合型单株在开花期继续与轮回亲本杂交获得BC2F1分离群体，并 以BC2F1-Pigm和BC2FrPi54 表示；
[0011] (4)重复步骤（3)，直至回交6代，获得BC6F1-Pigm和BC6F「Pi54并进行种植，苗期 提取各BC6F1分离群体中单株DNA，并利用与目标基因紧密连锁的分子标记进行PCR检测， 分别选择含有Pigm和Pi54基因的BC6F1杂合型单株在开花期进行聚合杂交，获得高质量杂 种F1种子，并以BC6F IPigm/Pi54^^'J、?
[0012] (5)种植BC6F1-Pwpi54群体，苗期提取分离群体中各单株DNA，并利用与目标基因紧 密连锁的分子标记进行PCR检测，选择同时含有Pigm和Pi54基因的杂合型单株收获种子， 获得双基因的BC6F2代群体，以BC6F2 Pigm/Pi54^^'J、;
[0013] (6)将BC6F2-Pigm/Pi54种植成1000株以上的群体规模，在苗期提取分呙群体中单株 的DNA，并利用与目标基因紧密连锁的分子标记继续进行PCR检测，选择Pigm和Pi54双基 因纯合且农艺性状和轮回亲本最为相似的单株；
[0014] (7)收获Pigm和Pi54双基因纯合的目标单株种子种植成BC6F3株系，开展穗瘟抗 性的人工接种和病圃自然诱发鉴定，同时开展农艺性状评价；选择人工接种和病圃自然诱 发鉴定中均表现抗病、且基本农艺性状与轮回亲本无明显差异的株系，获得穗瘟抗性得到 改良的育种材料。
[0015] 其中，与目标基因Pigm紧密连锁的分子标记优选ZJ58. 7,与目标基因Pi54紧密连 锁的分子标记优选Mil. 54。
[0016] 分子标记ZJ58. 7正向引物优选SEQIDNO. 1所示，反向引物优选SEQIDNO. 2所 不O
[0017] 分子标记Ml1.54正向引物优选SEQIDNO. 3所示，反向引物优选SEQIDNO. 4所 不O
[0018] 所述的轮回亲本为优良常规品种或两系杂交稻亲本扬稻6号。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 1)本发明采用分子标记辅助选择在每个回交世代对目标基因进行选择，无需田间 接种鉴定，简化了育种程序。
[0021] 2)本发明在分离世代针对目标抗性基因采用分子标记辅助选择的同时，不断采用 目测的方法选择农艺性状与轮回亲本最为相似的个体进行杂交和自交，获得初步成型的株 系后再进行农艺性状评价，减少了累赘连锁和遗传背景回复度的检测步骤，提高了育种选 择效率。
[0022] 3)本发明利用的两个目标抗性基因，这两个基因在具备苗瘟抗性的同时还具备穗 瘟抗性，其穗瘟抗谱重叠度小而互补性强，通过连续回交，并结合分子标记辅助选择，实现 在育种材料中的聚合，构建的聚合有Pigm/Pi54双基因的育种材料，能够减缓稻瘟病菌的 突变速率，保证目标材料穗瘟抗性的广谱、持久性。
【附图说明】
[0023] 图1为针对目标抗性基因Pigm和Pi54双基因纯合体的选择不意图。泳道1为供 体亲本谷梅4号或K3 ;2为轮回亲本扬稻6号；3-20为BC6F2自交群体的部分单株。红色箭 头标示目标双基因纯合体。
[0024] 图2为目标改良系YD6-Pigm/Pi54的穗瘟抗性表现。图2A为利用南方稻区分离 的120个单孢菌株的穗瘟抗性人工接种鉴定结果；图2B为湖北恩施、江西遂川和安徽金寨 3个病圃穗瘟抗性自然诱发鉴定结果；图2C为2007-2014年间利用湖北、海南和江苏3省 分离的单孢菌株的穗瘟抗性人工接种鉴定结果。
【具体实施方式】[0025] 实施例1
[0026] (1)以携带抗性基因Pigm的供体亲本谷梅4号（YiwenDeng,etal.Genetic characterizationandfinemappingoftheblastresistancelocusPigm(t) tightlylinkedtoPi2andPi9inabroad-spectrumresistantChinesevariety. TheoreticalandAppliedGenetics, 2006, 113(