一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于濒危野生植物中重要植物材料快速繁殖方法，特别是涉及野生兰花的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]沿兰^ M.microtatantha (Schlechter) Szlachetko ,兰科，中国特有种，国家II级保护植物(CITES II级)，地生小草本，假鳞茎小，卵形或近球形，叶I枚，接近铺地，卵形至宽卵形，花葶直立，纤细，常紫色，略压扁，两侧具很狭的翅；总状花序长I一2厘米，通常具10 — 20朵花，花很小，黄色，花期4月，分布于江西中部(东固)、福建(武夷山、永福、连江)和台湾东部(太鲁阁)。生于林下或阴湿处的岩石上，海拔200 - - 600米。与苔藓共生，对环境条件要求颇为苛刻，一般在人迹罕至、空气质量良好、植被茂盛、水源充足的环境才有分布，对于环境条件有一定指示意义。鉴于该植物，体型较小，如非处于花期，较难鉴定，且还存在自然繁衍能力、传播扩散能力不强，自然更新困难等问题，造成优良种苗稀缺。小沼兰植株再生有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，以有效地保护有限的野生资源为促进珍稀兰花品种的研宄、利用促进珍稀兰花品种的研宄、利用提供技术支持，诱导小沼兰鳞茎植株再生未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法。为促进珍稀兰花品种的研宄、利用提供技术支持。
[0004]本发明的方法是以如下方式实现的:
一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，具体步骤如下:
I)材料选取与消毒:将当天挖取的带叶假鳞茎植株用湿纱布包好，带回后置流水下冲洗干净，然后进行消毒处理，用于接种。
[0005]2)诱导培养:将消毒处理后材料，经滤纸吸干表面水分后平放接种于经高温、高压灭菌的鳞莖芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间5h/d，光照强度500?100Ix ;叶片逐渐出现白色并逐渐死亡，假鳞茎逐渐变绿、长大；
3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到的生长良好的直径成长为0.1-0.3 cm的假鳞茎，接种在增殖培养基中，光照时间5h/d，光照强度1000?13001x ；
4)诱导生根:将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株，转移到生根培养基中；光照时间6h/d，光照强度1300?1500Ix ;
5)移栽:当诱导生根培养试管苗生长至根I?3条，叶I片时，将试管苗放在自然光下炼苗5?7天，打开瓶盖炼苗1-2天；然后取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保湿遮阴(温度控制在15?25°C，湿度应保持在75 %?85 % )，获得生长健壮的完整再生植株。
[0006]2.培养基: (1)鳞茎芽诱导培养基VW+1.5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+0.3mg/L NAA+ 1.5g/L蛋白胨 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac+10 g/L 香蕉+60 g/L 土豆，pH 值为 5.6 ;
(2)增殖培养基VW+2.0mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+ 0.5mg/L NAA + 2g/L 蛋白胨+lg/L VB6+20 g/L 香蕉 +70 g/L 土豆 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6 ；
(3)生根培养基1/2VW+1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.5 g/L VB6+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6 ；
以上涉及:1、Ag为(Agar培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写)
2、Su为(Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写)
3、成熟度为80%香蕉(未经各种催熟处理)
4、土豆(为市售新鲜食用土豆，优选淀粉含量少的品种)。
[0007]本发明揭示了一种小沼兰鳞茎植株再生及快速繁殖技术，经过20-30d诱导培养，50-70d增殖培养，25-35d诱导生根，保湿遮阴，成活率可达95%以上。1_2周后植株适应能力逐渐增强，获得生长健壮的完整再生植株。
[0008]本发明的显著优点:
一:通过本发明方法可以最大限度地应用现有资源，通过生物技术手段在短时间内解决稀缺资源的应用需求；
二:有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，有效地保护有限的野生资源，为促进珍稀兰花品种的研宄、利用提供技术支持。
[0009]三:有关诱导小沼兰鳞茎植株再生及繁殖方法未见报道。
[0010]四:小沼兰假鳞茎在鳞茎芽诱导培养基上培养后逐渐变绿、长大，增殖系数高、生根率高，植物生长需求时间短，长势良好，整齐一致，大大缩短了苗木培养过程，节约了大量成本。为小沼兰的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。
[0011]五:本发明创新性强，技术含量高，公益性强，对于促进珍稀兰花品种的研宄、利用，有着良好前景和及其重要意义，为开发利用该种资源提供了理论依据和技术支持。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，具体步骤如下:
I)材料选取与消毒:1、将当天挖取带假鳞茎植株用湿纱布包好，带回实验室后置流水下将植株上尘土及植物体附着物冲洗干净；2、植株消毒处理:将冲洗后带叶假鳞茎植株置饱和漂白粉上清液中浸泡lOmin，并用小摄子仔细夹除靠近鳞茎基部杂质并进行清洗后，自来水下滴冲20 min，双蒸水冲荡2次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升未(HgCl2)处理8min，将未液倒入废未瓶，无菌水冲荡3遍，即可用与接种。
[0013]2)诱导培养:将消毒处理材料，经滤纸吸干表面水分后的带叶假鳞茎植株整个平放接种于经高温、高压灭菌的鳞茎芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间5h/d，光照强度8001x，培养时间20d ;叶片逐渐出现白色并逐渐死亡，假鳞茎逐渐适应专门设计配制的培养基并在此培养基上培养后逐渐变绿、长大；
3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到生长良好直径成长为0.2 cm的假鳞茎，分别接种在增殖培养基中，光照时间5h/d，光照强度12001x，，增殖培养时间55d ； 4)诱导生根:将继代诱导培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株分接，转移到生根培养基中；光照时间6h/d，光照强度14001x，诱导生根时间25d ；
5)试管苗培养完成:当诱导生根培养试管苗生长至根I条，叶I片时完成诱导小沼兰鳞茎植株再生并可以进行周期性繁殖培养；
6)将完成生根培养试管苗放在自然光下炼苗6天，打开瓶盖炼苗I天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后用摄子从培养瓶中取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土(1:2)混合的基质中，保湿遮阴(温度控制在20°C)，湿度保持在80%，避免阳光直射，成活率可达96%以上。I周后植株适应能力逐渐增强，获得生长健壮的完整再生植株。
[0014] 2.培养基:
培养基配制:培养基厚度为1.5cm ；
(1)鳞茎芽诱导培养基VW+1.5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+0.3mg/L NAA+ 1.5g/L蛋白胨 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac+10 g/L 香蕉+60 g/L 土豆，pH 值为 5.6 ;
(2)增殖培养基VW+2.0mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+ 0.5mg/L NAA + 2g/L 蛋白胨+lg/L VB6+20 g/L 香蕉 +70 g/L 土豆 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6 ；
(3)生根培养基1/2VW+1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1.5 g/L VB6+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6 ；
以上涉及:
1、Ag为(Agar培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写)
2、Su为(Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写)
3、成熟度为80%香蕉(未经各种催熟处理)
4、土豆(为市售新鲜食用土豆)
5、Ac为活性炭。
【主权项】
1.一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 1)材料选取与消毒:将当天挖取的带叶假鳞茎植株用湿纱布包好，带回后置流水下冲洗干净，然后进行消毒处理，用于接种； 2)诱导培养:将消毒处理后材料，经滤纸吸干表面水分后平放接种于经高温、高压灭菌的鳞茎芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间5h/d，光照强度500?100Ix ;叶片逐渐出现白色并逐渐死亡，假鳞茎逐渐变绿、长大； 3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到的生长良好的直径成长为0.1-0.3 cm的假鳞茎，接种在增殖培养基中，光照时间5h/d，光照强度1000?13001x ； 4)诱导生根:将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株，转移到生根培养基中；光照时间6h/d，光照强度1300?1500Ix ; 5)移栽:当诱导生根培养试管苗生长至根I?3条，叶I片时，将试管苗放在自然光下炼苗5?7天，打开瓶盖炼苗1-2天；然后取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保湿遮阴，温度控制在15?25°C，湿度应保持在75%?85%，获得生长健壮的完整再生植株。2.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述鳞茎芽诱导培养基:VW+L 5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+0.3mg/L NAA+ 1.5g/L 蛋白胨 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac+10 g/L 香蕉+60 g/L 土豆，pH 值为 5.6。3.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述增殖培养基:VW+2.0mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT+ 0.5mg/L NAA + 2g/L 蛋白胨+lg/L VB6+20 g/L 香蕉+70 g/L 土?+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6。4.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述生根培养基:1/2W+1.0 mg/L ΙΒΑ+0.1 mg/L NAA+1.5 g/L VB6+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g/L Ac，pH 值为 5.6。
【专利摘要】本发明属于濒危野生植物中重要植物材料快速繁殖方法，特别是涉及野生兰花的组织培养方法。该方法包括材料选取与消毒、诱导培养、增殖培养、诱导生根和移栽。本发明目的是提供一种采用假鳞茎诱导小沼兰植株再生及繁殖的方法。为促进珍稀兰花品种的研究、利用提供技术支持。本发明增殖系数高、生根率高，植物生长需求时间短，长势良好，整齐一致，大大缩短了苗木培养过程，节约了大量成本。为小沼兰的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104885934
【申请号】CN201510234271
【发明人】何碧珠, 林蔚, 刘江枫, 何官榕, 肖春梅
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月11日