生物材料性能的保存和储存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及储存真核细胞生物材料（例如与材料和组织相关联的细胞）的方法， 同时降低或防止储存相关的生物材料性能的损失。本发明还涉及在储存期间维持生物材料 的（i)胞外基质完整性（包括胞外基质渗透性、水含量和糖胺聚糖含量）以及（ii)细胞活 力。
【背景技术】
[0002] 在过去的几十年间，已开发了储存方法和技术以保存真核组织和细胞。这些储存 方法和技术涉及在工程改造的胞外基质、工程改造的组织和天然组织中将各种真核细胞储 存一段时间，储存方式允许在之后使用这些储存的组织，如用于植入或移植至患者或用于 药物或化学筛选生物试验。
[0003] 虽然这些储存方法和技术广泛地适用于基础研宄和转化研宄环境，但在储存期间 维持生物材料性能（例如胞外基质完整性和细胞活力）仍是一项挑战。例如，使用现有技 术时观察到了显著降低的胞外基质渗透性和组织细胞活力，且这些降低可导致从储存中取 出后低效的生物材料功能。
[0004] 在一个示例中，使用多种储存技术保存软骨细胞和软骨组织，随后将其从储存中 取出并用作骨软骨同种异体移植物。该同种异体移植物可修复（1)外伤诱导的软骨缺陷和 (2)由骨关节炎破坏的软骨表面。使用软骨细胞和软骨作为骨软骨同种异体移植物以治疗 骨关节炎是重要的，因为预测骨关节炎目前在美国影响约2000万人。因此，结果是，已产生 了一个巨大的产业用于提供整形外科植入物来治疗因内源性软骨缺失或内源性软骨损伤 而导致具有缺陷型关节、骨质疏松性骨折或背部疾病的人。
[0005] 虽然骨软骨同种异体移植物显示出治疗软骨相关医疗病症的希望，但移植的关节 软骨的软骨细胞活力和胞外基质完整性很大程度上决定了骨软骨同种异体移植物移植的 结果（即成功的手术效果对比失败的手术效果等）。目前的保存技术无法可接受地维持软 骨的胞外细胞基质完整性并在某些方面提高软骨细胞活力。例如，常规的软骨细胞和软骨 低温保存包括在包含二甲亚砜（DMSO)的溶液中冷冻这些细胞和组织，但这些技术导致关 节软骨中80 - 100%的软骨细胞死亡且胞外基质因为冰的形成而受损。
[0006] 上述较差的低温保存结果最终导致移植所谓"新鲜"关节部分（即软骨细胞和/或 软骨同种异体移植物）的实践。例如，通常在供体死亡的24小时内收获供体来源的骨软骨 组织移植物并在4°C下储存最多42天以用于修复临床软骨缺陷。此外，将市售可得的新鲜 骨关节同种异体移植物储存至少17天以允许在移植前进行血清学和微生物学测试以最小 化受体中的潜在感染。
【发明内容】
[0007] 虽然骨软骨同种异体移植物移植已经是用于修复（1)外伤诱导的软骨缺陷和（2) 由骨关节炎破坏的软骨表面的有效治疗方法，但对于在储存期间维持软骨的软骨细胞活力 和胞外基质完整性而言仍存在多项挑战。最近的研宄表明，重要的是同时维持软骨细胞活 力和胞外基质完整性以促进成功的同种异体移植物移植。例如，如果从储存中取出期间或 之后细胞活力和/或基质完整性降低，则成功移植的可能性也会降低。在工程改造或天然 的组织中的大多数真核细胞中都存在这些挑战。因此，新的真核组织和细胞保存技术是有 用的。
[0008] 本文描述了用于储存生物材料的组合物和方法。在某些方面中，这些生物材料包 括真核细胞和真核组织，如软骨细胞和软骨。本文所述方法包括以降低或防止储存期间或 从储存中取出生物材料后生物材料性能（如胞外基质渗透性和软骨细胞活力）损失的方式 储存这些生物材料。在某些方面中，将这些生物材料置于溶液中并随后储存以用于下次使 用，所述溶液包含动物来源的产物。在某些方面中，本文所述溶液含有防止或降低生物材料 性能损失的试剂，且在某些方面中，该试剂可包括至少一种酶的抑制剂。例如，该试剂可包 括天然或合成的基质金属蛋白酶（MMP)抑制剂，其包括但不限于内源性金属蛋白酶组织抑 制剂（TIMP)、调节TIMP合成的化合物或多西环素等。
[0009] 本发明的优势部分列于后文说明书中或可通过下文所述方面的实践进行了解。通 过所附权利要求中特别指出的要素和组合将会认识和获得下述优点。应当理解，上述一般 描述和以下详细描述仅仅是示例性和说明性的，而非限制性的。
【附图说明】
[0010] 图1比较软骨细胞在四种不同溶液中储存28天后的软骨细胞活力和增殖。通过 测量各样品的相对荧光单位（RFU)来定量活力和增殖。
[0011] 图2显示4种不同溶液中冷储存期间高细胞活力与软骨基质渗透性和电导率损失 之间的关联系数（R 2)。如图2所示，在4天的储存后恢复组织培养期间，关联系数从0. 78 升尚至〇. 90。
[0012] 图3显示低温储存对于软骨渗透性的影响，其基于低渗盐水中软骨样品的电导 率。
[0013] 图4是用于定量软骨机械性能（如蠕变压缩）的压缩室的示意图。
[0014] 图5显示多种储存间隔后多西环素浓度对于软骨细胞活力的影响。
[0015] 图6显示在多种多西环素浓度中冷冻储存一个月后对猪软骨塞电导率的影响。
[0016] 实施方式详沐
[0017] 通过参考以下特定实施方式的详述、本文包含的实施例以及附图及其描述，可以 容易地理解公开的方法和组合物。下文所述各方面不限于所述特定组合物和/或方法，其 当然可以变化。
[0018] 本申请引用了多份出版物。这些出版物全文以及下文参考文献列表中包含的出版 物的公开内容在此通过引用全文纳入本申请中以更完整地描述本申请所属领域的状态。所 公开的参考文献还根据参考的特定部分单独和特定地通过引用纳入本文。
[0019] 可以以范围的形式表示或给出浓度、数量和其它数值数据。应该理解，使用这种范 围形式只是为了方便和简洁，因此，应该灵活地将其解释成不仅包括作为范围界限明确列 举的数值，而且包括所有包含在该范围内的单个数值或子范围，就如同各数值和子范围都 已明确列举。例如，"约1至5"的数值范围应理解为不仅包括明确表示的约1至约5的数 值，还单独地包括单个值（如2、3和4)和子范围（如1-3、2-4和3-5等）以及1、2、3、4和 5。相同的原理适用于仅仅陈述了一个作为最小值或最大值的数值的范围。此外，无论所描 述的范围或特征的宽度如何，这种解释都适用。
[0020] 在本说明书和后面的权利要求书中将提到许多术语，这些术语应具有以下定义：
[0021] "不含动物产品"的溶液包括除下文所述生物材料外不包含动物产品或来源于动 物的任何产品的溶液。"动物产品"可包括胎牛血清（FBS)，其是包括生长因子的动物来源 的产品并通常用于常规细胞培养。因此，在一个示例中，"不含动物产品"的溶液可包括缺少 FBS的溶液。
[0022] 术语"生物材料"包括非植物、哺乳动物真核细胞和组织。
[0023] 本文描述了活生物材料和用于储存这类生物材料的方法。在某些方面中，这些生 物材料包括工程改造和天然的组织中的真核细胞，且本文所述方法包括以降低或防止储存 期间或从储存中取出生物材料后生物材料性能损失（例如，降低或防止胞外基质渗透性、 组织细胞活力或其组合的损失）的方式储存这些生物材料。在某些方面中，将这些生物材 料置于溶液中，其可包括不含动物产品的溶液，含有至少一种降低或防止生物材料性能损 失的试剂。随后，将置于含有至少一种试剂的溶液中的生物材料在特定温度范围下储存直 至进一步需要这些生物材料时。对至少一种试剂的浓度进行优化从而最大化生物材料性能 (如胞外基质完整性和细胞活力）。
[0024] 在某些方面中，该生物材料可包括任何非植物、哺乳动物真核细胞和/或组织，包 括原代细胞（如非永生细胞和/或组织）和永生细胞。在某些方面中，该生物材料可包括 天然和工程改造的组织和细胞。天然和工程改造的生物材料的示例可包括但不限于：软骨 细胞、软骨、成骨细胞、破骨细胞、骨、组织塞（tissue plug)、同种异体移植物组织塞、软骨 组织塞、角膜、心脏瓣膜、血管、输尿管、肠、皮肤、牙齿、肿瘤活检、椎间盘或椎间体、韧带、肌 腱等。在至少一个方面中，该生物材料包括至少软骨细胞、软骨或其组合。在其他方面中， 该生物材料仅包括软骨细胞、软骨或其组合。在某些方面中，该生物材料包括自体移植物组 织、同种异体移植物组织和异种移植物组织。例如，对于合适的人移植物组织，同种异体组 织和/或组织塞可来源于人供体。异种移植物组织可来源于猪供体、牛供体、绵羊供体、马 供体或任何其他物种以用于医疗目的。本文所述组织还可来源于相同物种中兽医应用的动 物物种；示例包括狗、猫、绵羊、奶牛和马。
[0025] 在由本文所述组合物和方法使用本文所述组织和细胞时，一个目的是防止胞外基 质完整性的损失和/或降低或防止细胞活力的损失。例如，可基于胞外膜渗透性、胞外膜水 含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其组合来测定胞外基质完整性。在某些方面中，在储存生物材 料以防止或降低胞外基质完整性损失时，一个目的是维持胞外膜渗透性、胞外膜水含量、胞 外膜糖胺聚糖含量或其组合中的至少一种。在测定生物材料的基质完整性时，可使用本领 域已知的多种技术。这些技术包括测量渗透性、水含量和糖胺聚糖含量的基质电导率试验、 凹痕测试、压力/应变测试、弹性、拉曼光谱、各种显微镜方法（如具有二次谐波发生的激光 扫描显微镜）等。如上文进一步说明的那样，另一个目的是降低或防止生物材料细胞活力 的损失。在某些方面中，可使用本文所述组合物和方法来降低或防止多种类型的细胞死亡， 包括但不限于，坏死性细胞死亡、凋亡性细胞死亡、自噬性（II型）细胞死亡、失巢凋亡和坏 死性凋亡，并且在某些方面中，可通过使用下文进一步描述的试剂来限制这些类型的细胞 死亡。此外，还可以使用代谢活性试验（如刃天青试验）、各种细胞染色技术（如过