一种脱除马铃薯试管苗pvs病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业育苗技术领域，尤其涉及一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法。
【背景技术】
[0002]中国马铃薯种植面积有570余万hm2，居世界首位，但产量水平较低(15.45t.hm-2)，不仅低于世界平均单产(17.26t.hm_2)，更不及世界发达国家(50.25t.hm-2)。病毒病危害是影响中国马铃薯产量的主要因素之一，由于马铃薯为营养体繁殖，病毒随马铃薯繁殖而逐年积累，导致马铃薯种性退化，研宄证明马铃薯病毒引起马铃薯减产在30%?50%，如果不同病毒混合侵染，则可以造成80%以上的产量损失。据报道，感染马铃薯的病毒达30种以上，在中国危害比较严重的主要有马铃薯X病毒(PVX)(减产10?20% )、马铃薯Y病毒(PVY)(减产50?80% )、马铃薯S病毒(PVS)(减产10?20%)、马铃薯A病毒(PVA)(减产40%以上)、马铃薯M病毒(PVM)(弱株系减产10?20%，强株系减产60?70% )以及马铃薯卷叶病毒(PLRV)(减产40?70% )。在马铃薯试管苗和原原种生产中PVS是危害最重的一种病毒，检出率最高。
[0003]目前最常用的脱毒技术依然是传统的茎尖脱毒技术，该方法主要是对经过变温或高温处理的马铃薯块茎上的芽进行茎尖剥离以获得脱毒苗，对于大多数病毒来说，此方法是方便且有效的，但是对于携带PVS的马铃薯材料来说此方法却很难得到满意的效果。PVS的脱除对茎尖剥离技术要求较高，仅带I个叶原基的生长点(0.1?0.3mm)才有可能脱掉PVS，且剥离茎尖大小与茎尖成苗率呈正相关但与脱毒效果成负相关，马铃薯块茎的芽的茎尖相对较大，PVS离生长点很近，更不易脱除，所以同一品种经常反复几年进行大规模的茎尖剥离才能获得不带PVS的种苗，增加了劳动投入和检测成本，难以满足生产需求。同样单一应用热处理和病毒唑处理脱除马铃薯试管苗PVS的效果也不明显，也有将三种技术中两两组合来脱除PVS的处理方法，但因温度处理周期不同、药剂浓度不同和方法操作顺序不同等因素，结果存在很大差异，脱毒率O?83%不等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，旨在解决现有茎尖脱毒技术对于携带PVS的马铃薯材料处理效果较差的问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，包括以下步骤:
[0006](I)预处理试管苗的茎尖剥离
[0007]在无菌条件下剪取长度0.5?Icm预处理过的试管苗的苗尖，置于铺有润湿的灭菌滤纸的培养皿中，在解剖镜下进行分生组织剥离，切取长度为0.1?0.3_带有I?2个叶原基的茎尖，以茎尖向上、切面向下的方向置于茎尖培养基中培养；
[0008](2)茎尖培养
[0009]在温度22±2°C、光照时间12h?15h/d、光照强度2000?30001x条件下，将茎尖培养40?50d，期间，将长度0.5cm以上的茎尖苗转接到MS培养基中，将未分化的茎尖愈伤组织或长度小于0.5cm的小苗继续转接到茎尖培养基中培养；
[0010](3)茎尖成苗的PVS病毒检测
[0011]对茎尖成苗采用酶联免疫吸附法进行检测，保留合格的茎尖成苗，整个周期120?180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。
[0012]优选地，在步骤(I)中，所述预处理具体包括:将经检测含有PVS的试管苗去顶尖切段置于添加30?40mg/L病毒唑和10?20mg/L 丁酰肼的MS固体培养基的培养瓶中，每瓶15棵，于温度23?25°C，光照时间15h/d，光强2000?30001x的条件下培养15?20d，剔除细菌和真菌污染的瓶苗，待新生苗最长根长达0.5cm时，将培养瓶转移至光照培养箱中进行变温交替处理，温度40°C /6h和25°C /6h，光照时间12h/d，光强2000?30001x，培养60?80d后，取苗尖进行茎尖剥离。
[0013]优选地，在步骤(I)中，所述茎尖培养基包括以下组分:基础培养基MS、0.05mg/LNAA、0.lmg/L6-BA、0.2mg/LGA3、0.2mg/L 泛酸钙、30g/L 蔗糖以及 6g/L 琼脂。
[0014]相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明综合应用改良的变温、化学试剂和茎尖分生组织培养相结合的方法脱除马铃薯试管苗PVS病毒，并应用改良的茎尖专用培养基培养茎尖，确保变温处理苗的茎尖成苗率在60%以上，整个脱毒周期120?180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。10个品种PVS脱除率均值为66%，最高的达到了 100%，显著高于传统的茎尖剥离方法。本发明适用于对马铃薯品种资源脱除PVS病毒的批量操作，一次性即可获得合格种苗，避免重复劳动，脱毒率高，脱毒效果稳定，降低检测成本。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0016]一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0017](I)试管苗材料的预处理
[0018]将经检测含有PVS的试管苗去顶尖切段置于添加30?40mg/L病毒唑和10?20mg/L丁酰肼的MS固体培养基的培养瓶中，每瓶15棵，于温度23?25°C，光照时间15h/d，光强2000?30001x条件下培养15?20d，剔除细菌和真菌污染的瓶苗，待新生苗最长根长达0.5cm时，将培养瓶转移至光照培养箱中进行变温交替处理，温度40°C /6h和25°C /6h，光照时间12h/d，光强2000?30001x，培养60?80d后，取苗尖进行茎尖剥离；
[0019](2)预处理试管苗的茎尖剥离
[0020]在无菌条件下用剪刀剪取长度0.5?Icm预处理过的试管苗的苗尖，置于铺有润湿的灭菌滤纸的培养皿中，在30?40倍解剖镜下进行分生组织剥离，切取长度为0.1?0.3mm带有I?2个叶原基的茎尖，以茎尖向上、切面向下的方向置于茎尖专用培养基中培养，茎尖培养基为改良的茎尖一步成苗培养基MS+0.05mg/LNAA+0.lmg/L6-BA+0.2mg/LGA3+0.2mg/L泛酸钙+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。茎尖剥离时速度一定要快，且须将芽尖或苗尖放在无菌潮湿的滤纸上，以防剥离的幼小茎尖失水死亡；
[0021](3)茎尖培养
[0022]茎尖培养温度控制在(22 ± 2) °C，光照时间12h?15h/d，光照强度2000?30001xo茎尖培养40?50d时要将长度0.5cm以上的茎尖苗转接到MS培养基中，将未分化的茎尖愈伤组织或长度小于0.5cm的小苗继续转接到茎尖培养基中培养，避免茎尖新生苗因营养匮乏提前衰老或污染导致死亡，转接过程中必须剔除被细菌、真菌污染和生长不正常的茎尖苗。另外，在茎尖转接的过程中避免不同茎尖交叉感染，严格执行茎尖苗“一尖一号”的编号制度。
[0023](4)茎尖成苗的PVS病毒检测
[0024]对茎尖成苗采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行检测，保留合格的茎尖成苗，整个周期120?180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。
[0025]本发明综合应用改良的变温、化学试剂和茎尖分生组织培养相结合的方法脱除马铃薯试管苗PVS病毒，并应用改良的茎尖专用培养基培养茎尖，确保变温处理苗的茎尖成苗率在60%以上，整个脱毒周期120?180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。10个品种PVS脱除率均值为66%，最高的品种达到了 100%，显著高于传统的茎尖剥离方法。本发明适用于对马铃薯品种资源脱除PVS病毒的批量操作，一次性即可获得合格种苗，避免重复劳动，脱毒率高，脱毒效果稳定，降低检测成本。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)预处理试管苗的茎尖剥离 在无菌条件下剪取长度0.5?Icm预处理过的试管苗的苗尖，置于铺有润湿的灭菌滤纸的培养皿中，在解剖镜下进行分生组织剥离，切取长度为0.1?0.3_带有I?2个叶原基的茎尖，以茎尖向上、切面向下的方向置于茎尖培养基中培养； (2)茎尖培养 在温度22±2°C、光照时间12h?15h/d、光照强度2000?30001x条件下，将茎尖培养40?50d，期间，将长度0.5cm以上的茎尖苗转接到MS培养基中，将未分化的茎尖愈伤组织或长度小于0.5cm的小苗继续转接到茎尖培养基中培养； (3)茎尖成苗的PVS病毒检测 对茎尖成苗采用酶联免疫吸附法进行检测，保留合格的茎尖成苗，整个周期120?180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。
2.如权利要求1所述的脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，其特征在于，在步骤(I)中，所述预处理具体包括:将经检测含有PVS的试管苗去顶尖切段置于添加30?40mg/L病毒唑和10?20mg/L 丁酰肼的MS固体培养基的培养瓶中，每瓶15棵，于温度23?25°C，光照时间15h/d，光强2000?30001x的条件下培养15?20d，剔除细菌和真菌污染的瓶苗，待新生苗最长根长达0.5cm时，将培养瓶转移至光照培养箱中进行变温交替处理，温度400C /6h和25°C /6h，光照时间12h/d，光强2000?30001x，培养60?80d后，取苗尖进行茎尖剥离。
3.如权利要求1所述的脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，其特征在于，在步骤(I)中，所述茎尖培养基包括以下组分:基础培养基MS、0.05mg/LNAA、0.lmg/L6_BA、0.2mg/LGA3、0.2mg/L 泛酸l1、30g/L 鹿糖以及 6g/L 琼脂。
【专利摘要】本发明提供了一种脱除马铃薯试管苗PVS病毒的方法，通过将预处理试管苗的茎尖进行剥离后，以茎尖向上、切面向下的方向置于茎尖培养基中培养，然后在温度22±2℃、光照时间12h～15h/d、光照强度2000～3000lx条件下，将茎尖培养40～50d，期间，将长度0.5cm以上的茎尖苗转接到MS培养基中，将未分化的茎尖愈伤组织或长度小于0.5cm的小苗继续转接到茎尖培养基中培养；最后对茎尖成苗采用酶联免疫吸附法进行检测，保留合格的茎尖成苗，整个周期120～180d即可获得不带PVS的马铃薯种苗。本发明PVS病毒脱除率高，适用于对马铃薯品种资源脱除PVS病毒的批量操作，一次性即可获得合格种苗，避免重复劳动，脱毒率高，脱毒效果稳定，降低检测成本。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104813935
【申请号】CN201510187562
【发明人】卢丽丽, 杨琼芬, 刘凌云, 包丽仙, 尹自友, 隋启君, 李燕山
【申请人】云南省农业科学院经济作物研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月20日