东北红豆杉组织培养快速繁殖方法
【专利说明】
[0001]技术领域本发明涉及生物技术。利用组织培养技术快速繁殖东北红豆杉优质苗木。
[0002]【背景技术】东北红豆杉(Taxus cuspidata)属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)常绿针叶乔木。东北红豆杉用途:(I)紫杉醇:从植株提取的紫杉醇对肺癌等多种肿瘤具有很好的治疗效果，由于其广谱性和疗效佳，被誉为抗癌药物的今日之星；
[2]中药:根、茎、叶、皮均可入药，可治疗高血压、糖尿病、心脏病等症；(3)用材:材质优良，适用于乐器、雕刻、高级家具、美工装饰等用途；(4)绿化:树形优美，浆果鲜红色，其枝叶四季浓密苍翠，是东北地区少有的常绿观赏树种；(5)其他:植株含有紫杉素(TaxinC37H51N010)、东北红豆杉精油(剧毒)、单宁、红色素、植物油等。
[0003]东北红豆杉天然种群数量的稀少，雌雄异株，花粉无气囊，飞散距离短，最佳授粉期很短，东北红豆杉植株结实量属于低产稳产型，即绝大多数年份结实量很少，并且种皮坚硬(透气透水性差)、种子内含有萌发抑制物、种胚发育不完善等导致种子深度休眠。种子休眠期长、发芽率低导致东北红豆杉种群实生苗数量数量减少，降低了遗传多样性，被列为国家一级重点保护的野生珍稀濒危植物。
[0004]
【发明内容】
(I)芽体增殖:取东北红豆杉芽鳞未展开之芽苞为外植体，接种到改良的MS培养基中添加6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，芽体增殖效果较好。(2)不定根诱导:东北红豆杉幼嫩芽体，不定根发生较缓慢，不定根发生有两种方式，即愈伤组织生根型与皮层生根型，愈伤组织生根型较多。(3)移栽与驯化:以苔藓为基质时，移栽后成活率较高。组培苗移栽时保持较高的空气相对湿度，有利于维持幼苗的水分平衡和移栽成活。在驯化期间逐渐降低空气相对湿度，经常喷施杀菌剂，可以提高移栽成活率。
【具体实施方式】
[0005](I)外植体表面灭菌:在初级培养时，在超净工作台上用75%酒精先对外植体(东北红豆杉嫩芽)消毒30s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgC12消毒lOmin，最后用无菌水冲洗3?4次，备用。
[0006](2)芽体增殖培养:在MS培养基中分别加入80mg/L酵母提取物和水解酪蛋白，加入6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)0.lmg/L和萘乙酸(NAA)0.5mg/L，培养基中蔗糖用量均为30g/L，琼脂用量为10g/L，培养基ρΗ5.5，配制好的培养基在1.05mPa(12rC )条件下灭菌20min，灭菌后的培养基平放于工作台上，冷却备用。在超净工作台内接种外植体，接种后置于培养室内培养。培养条件为，温度22?28°C，每日光照时间10?12h，光照强度I 800?2 OOOlx0
[0007](3)不定根诱导:先将东北红豆杉芽体转移到1/2MS培养基上，在短日照(光8h、暗16h)、低温(日20°C，夜17°C )条件下培养45天，再转接到1/2MS培养基加入吲哚丁酸(IBA) 3.5mg/L和NAA0.3mg/L上，继续培养20-30天，开始发生不定根，不定根发生的形式有两种，一种是皮层直接生根，另一种是愈伤组织生根。
[0008](4)组培苗移栽:组培苗的不定根长到1.5cm左右时，用镊子将试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗去粘附的培养基，勿伤苗体，浸入浓度为1.2g/L的多菌灵水溶液中，药浴20min，移栽基质分别为苔藓在高温、高压条件下灭菌。冷却至室温后，把经过药浴的东北红豆杉试管苗，移栽到盛有不同基质的秧盘中，浇透水。将秧盘置于恒温恒湿培养箱内进行组培苗驯化。驯化条件为，第I周温度25°C，空气相对温度80?90% ;第2周温度为23°C，空气相对温度70?80% ;第3周温度为20°C，空气相对湿度60?70%。在驯化期间每周喷一次浓度为1.2g/L多菌灵水溶液。经过3?5周的驯化培养后，组培苗便可以适应外界条件。从培养箱内取出组培苗，放在温室内按常规育苗方式进行管理。
【主权项】
1.以东北红豆杉嫩芽为外植体进行增殖培养效果较好。
2.为改良的MS+0.lmg/L6-BA+0.5NAA可实现东北红豆杉组培苗的快速繁殖。
3.东北红豆杉组培苗在1/2MS培养基上先木质化培养，再诱导不定根。
【专利摘要】本发明涉及东北红豆杉组织培养快速繁殖方法。东北红豆杉是一种可以提取紫杉醇治疗多种肿瘤，还可以绿化、用材、中药等用途。以东北红豆杉嫩芽为外植体，接种到加入6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)改良的MS培养基，进行增殖培养。芽苗在1/2MS培养基上诱导不定根，且根系较发达。取出生根苗，在1.2g/L的多菌灵水溶液中浸泡20min后，移栽到苔藓基质中，管理好温度和湿度，喷施杀菌剂，组培苗成活率高。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104620985
【申请号】CN201510069096
【发明人】程广有, 唐晓杰, 王明启, 杨振国
【申请人】北华大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月3日