一种哲罗鲑精液超低温冷冻保存液及哲罗鲑精液的冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼类精液低温冷冻保存液及哲罗鲑精液的冷冻保存方法。
【背景技术】
[0002]哲罗鲑属鲑形目、鲑科、隶属于哲罗鲑属；濒危等级为易危。由于哲罗鲑营养丰富，肉质细嫩，肉味鲜美，深受广大消费者青睐；因此，近年来市场对哲罗鲑的需求量不断增加。尽管哲罗鲑的商业化养殖与育种事业得到了大力发展，但在进行选育工作中种质资源的保护却一直被忽视，导致哲罗鲑杂交育种过程中近交种质退化愈演愈烈，遗传多样性降低，品质下降，生长性能低下，大部分养殖品种对病害和环境胁迫的防御能力降低，病害频发，因而给养殖企业造成了巨大的经济损失。
[0003]自从上个世纪50年代，英国学者Blaxter首次成功对鱼类精巢进行冷冻以来，国外许多学者对鱼类精子的长期冷冻保存也进行了相关研宄和探索，不但对鱼类的生命进程具有重要意义，而且对培育鱼类新品种及其商业化养殖也将产生巨大的深远影响。
[0004]虽然，长期冷冻技术在其他鱼种有过成功案例，但是哲罗鲑的精子冷冻再解冻后存在活率低(30%左右)，存活精子的活力低、活动率(运动比例不到20% )大幅下降的问题，导致哲罗鲑的精子目前却仍然无法通过长期冷冻技术进行保存。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决现有哲罗鲑精子长期冷冻技术存在的活率低，存活精子的活力低、活动率大幅下降的问题，而提供的一种哲罗鲑精液超低温冷冻保存液及哲罗鲑精液的冷冻保存方法。
[0006]本发明哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中按摩尔比K+: Na+〈I: 16，哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中K+浓度为0.00480mol/L?0.00682mol/L。
[0007]哲罗鲑精液超低温冷冻保存液由7.95?8.07g的NaCl、0.325?0.475g的KC1、0.12 ?0.15g 的 CaCl2、0.349 ?0.351g 的 NaHCO3> 0.059 ?0.061g 的 ΚΗ2Ρ04、0.30 ?0.38g的葡萄糖和100ml的蒸馏水组成。
[0008]采用上述哲罗鲑精液超低温冷冻保存液冷冻保存哲罗鲑精液按以下步骤进行:
[0009]一、采集哲罗鲑新鲜精液；
[0010]二、向7.92ml哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩涡混匀器充分混合，然后置于4°C环境中平衡15分钟，再放入新鲜哲罗鲑精液进行混合，充分混匀后置于4°C环境中平衡I分钟，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C环境中平衡I分钟，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷冻保存混合液；
[0011]三、将精液冷冻保存混合液用微量移液器分装于麦管中，然后放置于4°C环境中备用；
[0012]四、将液氮导入带盖泡沫箱中，移入麦管中的精液冷冻保存混合液在距离液氮液面上方8cm处停留5?15min，然后在距液氮液面上方4cm处停留3?8min，再将麦管直接投入液氮中长期保存；
[0013]五、解冻采用快速水浴解冻法；其中，步骤二中新鲜哲罗鲑精液的加入量为3ml。
[0014]哲罗鲑不同于其他海水鱼类和温水性鱼类，哲罗鲑的精子只有在特定离子浓度的溶液中才能保持静止不被激活(不做直线或漩涡运动)，而且还要同时保持超低温冷冻保存液中K+与Na +之间的特定比例关系方能够实现。
[0015]本发明哲罗鲑精液超低温冷冻保存液将K+浓度设计为0.00480mol/L?0.00682mol/L，保持哲罗鲑精子静止不被激活；而且解冻后哲罗鲑精子的活动力高，运动比例彡50%、存活率彡60%。
[0016]采用本发明的冷冻保存方法哲罗鲑精子可以保存3?15年，甚至更长的时间。哲罗鲑精子冷冻保存3年解冻后哲罗鲑精子的活动力高、运动比例多50%，存活率多60%。
[0017]本发明方法简单易行，具有冷冻保存时间长，解冻后精子质量高的优点。
[0018]通过对哲罗鲑精子冷冻保存解决了哲罗鲑繁殖期不同，各繁育群体之间无法配育种的问题；尤其是遗传距离较远的品系、种之间的杂交。哲罗鲑精子冷冻保存还使跨区域杂交繁育得而实现，降低了运输成本，也避免了运输过程中活体死亡造成的风险。
[0019]本发明哲罗鲑精子冷冻保技术对未来商业养殖种，避免自群繁育、近亲交配或小群体繁殖具有重大意义。也能够有效防止哲罗鲑基因丢失和遗传嬗变所导致的种质退化。
[0020]本发明对哲罗鲑的优良品种的种质保存、遗传多样性保护、遗传育种、人工繁殖具有深远影响。使建哲罗鲑的冷冻精子库，形成遗传背景档案变为可能。可以更好地对应突发疾病、自然灾害、或水域污染等对哲罗鲑物种造成的威胁。
【具体实施方式】
[0021]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0022]【具体实施方式】一:本实施方式哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中按摩尔比K+:Na+〈1: 16，哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中K+浓度为0.00480mol/L?0.00682mol/L。
[0023]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:哲罗鲑精液超低温冷冻保存液由 ?.95 ?8.07g 的 NaCl、0.325 ?0.475g 的 KC1、0.12 ?0.15g 的 CaCl2、0.349 ?0.351g 的 NaHCO3>0.059 ?0.061g 的 ΚΗ2Ρ04、0.30 ?0.38g 的葡萄糖和 100ml 的蒸馏水组成。其它与实施方式一相同。
[0024]本实施方式中HCO3IP H2PCV具有弱电离作用，会形成弱碱效果，提高精子的受精能力；并且能够增加哲罗鲑的精子活力。
[0025]葡萄糖不但能给精子提供外源能量，还能在精子外层形成保护膜，在冷冻状态抑制碱性环境对哲罗鲑精子造成的能量损失，而在解冻后葡萄糖会迅速溶于水，解除对哲罗鲑精子的糖衣保护，使精子更好的在碱性环境发挥作用。因此，即使是在弱碱性的冷冻保存液中哲罗鲑精子头部内的能量仍能够在长期低温环境被保留下来，不被消耗掉。
[0026]葡萄糖不但解决了其他离子对哲罗鲑精子的损伤作用，还解决了降低了抗冻剂的毒性作用。
[0027]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:哲罗鲑精液超低温冷冻保存液由 8.0lg 的 NaCK0.4g 的 KCl,0.14g 的 CaCl2、0.35g 的 NaHC03、0.06g 的 KH2PO4'0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸馏水组成。其它与实施方式一相同。
[0028]【具体实施方式】四:本实施方式哲罗鲑精液按以下步骤进行冷冻保存:
[0029]一、采集哲罗鲑新鲜精液；
[0030]二、向7.92ml哲罗鲑精液超低温冷冻保存液中添加0.27ml丙三醇，用漩涡混匀器充分混合，然后置于4°C环境中平衡15分钟，再放入新鲜哲罗鲑精液进行混合，充分混匀后置于4°C环境中平衡I分钟，之后再添加0.27ml丙三醇充分混合放于4°C环境中平衡I分钟，而后再添加0.54ml丙三醇，充分混合，即得到精液冷冻保存混合液；
[0031]三、将精液冷冻保存混合液用微量移液器分装于麦管中，然后放置于4°C环境中备用；
[0032]四、将液氮导入带盖泡沫箱中，移入麦管中的精液冷冻保存混合液在距离液氮液面上方8cm处停留5?15min，然后在距液氮液面上方4cm处停留3?8min，再将麦管直接投入液氮中长期保存；
[0033]五、解冻采用快速水浴解冻法；其中，步骤二中新鲜哲罗鲑精液的加入量为3ml。
[0034]本实施方式中哲罗鲑精液超低温冷冻保存液由8.0lg的NaCl、0.4g的KC1、0.14g的CaCl2、0.35g的NaHC03、0.06g的KH2P04、0.34g的葡萄糖和1000ml的蒸馏水组成。
[0035]本实施方式中丙三醇为抗冻剂。
[0036]本实施方式步骤一采集哲罗鲑新鲜精液:将体壮健康的哲罗鲑雄鱼从水池捞出，使用浓度为5ml/L的苯氧乙醇水溶液进行麻醉；待哲罗鲑进入麻醉状态，将其体表和生殖孔反复用干燥的无菌纱布擦净；之后从头向尾方向反复强力按压上腹部(约侧线鳞上方)，成熟的精液少量流出，用2ml吸管或5ml注射器连续采集持续流出的精液，吸满后不断放入大口容器中，并4°C低温暂存。通过人工挤压腹部采集精液是最常用的方法，注意在采集时要防止水、血液、体表粘液、尿液和粪便等对精液的污染。
[0037]采集哲罗鲑新鲜精之后对精液质量进行鉴定:取适量精液，利用等温的水或低渗钠盐溶液激活精子，镜检精子的活力状况，成熟的精子激活后应立即作快速的直线运动，或涡旋运动；活动率在80%以上的精液方可进行冷冻保存。
[0038]本实施方式通过哲罗鲑精液超低温冷冻保存液与被保存的哲罗鲑精液形成混合物，并发生相互作用，在本实施方式特定的降温过程中精液本身带有的精浆成分会缓解遇到冷冻保存液而遭遇低渗吸水的可能，随着精浆成分与冷冻保存液的不断融合，使冷冻保存液中的离子发挥了稳定渗透压的作用，保护了精子并降低了抗冻剂毒性。
[0039]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】四的不同点是:步骤四中液氮液面距离箱口 12cm?15cm。其它步骤及参数与实施方式四相同。
[0040]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】四或五的不同点是:步骤五快速水浴解冻法:将冷冻保存的麦管进行水浴解冻，水浴水温为25°C?30°C，解冻时间为15?18s，解冻过程中摇动麦管。其它步骤及参数与实施方式四或五相同。
[0041]实施例1
[0042]哲罗鲑精液按以下步骤进行冷冻保存:
[0043]—、采集哲罗鲑新鲜精液，经检测精子活动率为85.4% ;
[0044]二、向7.92ml哲罗鲑