专利名称：自动脱叶的植物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及具有新的和改良特性的棉属植物(Gossypium hirsutumL)，尤其是具有自动脱叶之特性的棉属植物。本发明还涉及决定自动脱叶之特性的一个或多个基因。
背景技术：
在包括澳大利亚的很多国家，棉花生产是主要的工业。所有的棉花纤维都是由Gossypium属植物产生。种植最多的棉属植物品种是Gossypiumhirsutum(American Upland棉花)，该品种产生中等纤维长度的棉花，在可得到充分灌溉的美国，澳大利亚，巴基斯坦和其它国家可以种植该品种。埃及棉花具有较细长的纤维，是由Gossypium barbadense产生的，在埃及和苏丹得以广泛种植。在印度，巴基斯坦和其它亚洲国家无法灌溉的地区种植的是草棉和树棉，它们产生较粗短的纤维。
商购种子贮存物的纯度被小心地管理着以避免品种之间的杂交或种子混合造成的问题。
然而，传统意义上的棉属植物培养需要高强度的农业实践，包括深灌溉和使用杀虫剂。如Heliothis caterpillar的多种害虫和多种棉铃虫使棉属植物趋向于病害和侵扰，迄今为止，控制这些害虫需要广泛使用化学杀虫剂。另外，由于需要机械收获，在收获前需使用脱叶剂以除去植物的叶，使棉铃易于进入收获的机械。
因此，棉花种植业成为相当严重的环境污染的诱因，该行业处于减少向环境中释放化学物质的强大压力之下。人们越来越多地使用一体化的害虫管理技术，经基因工程的技术被改造成对病害具有抗性，或可表达细菌来源的天然杀虫剂苏云金芽孢杆菌毒素的棉属植物逐渐为棉花种植者所用。然而，迄今为止尚无可替代收获前使用化学脱叶剂的方法。
尽管据说多年生棉花的野生种，如G.aridum D4，G.GossypioidesD6和G.trilobum D在旱季到来时会失去在雨季时长出的叶，但迄今为止未在商业种植的棉株中发现自动脱叶现象。
多年以来，人们尽量使用传统的繁殖方法以鉴定和选择对侵扰这些植物的主要昆虫和真菌病害具有改良抗性或具有其它所需特性的棉株。同时，繁殖的计划针对的是产生自动生色的棉花，这样就不需要在织物加工的过程中使用化学染料了。
前苏联技术科学研究院成员Vitor Fursov教授于1962年3月倡导了棉属植物发展计划。
1962至1993年之间的计划涉及开发在商业条件下繁殖和受试的，具有特别之特征的棉株。它们包括具有绿色，米色，棕色和雪白等多种颜色的棉株。人们惊奇地发现自动生成米色和棕色的棉株对主要的昆虫和真菌病害具有超级抗性并具有杀细菌的特性。
在澳大利亚进行的对棉株的进一步开发，产生和选择鉴定出某些具有自动脱叶之特性，而无需使用化学脱叶剂的棉株。
发明简述本发明一方面提供了自动脱叶的棉属植物。在一个实施方案中，植物具有经激活后可影响棉属植物自动脱叶的基因或其功能性片段。
特别优选的实施方案中提供了棉株(Gossypium hirsutum)，其特征在于植本发明还提供了自动脱叶的植物，其包括经激活后可影响棉属植物自动脱叶的核酸或其功能性片段。
本发明的第二方面涉及自动脱叶的棉属植物，其具有如图3所示的DNA指纹图。植物含有决定棉株自动脱叶的核酸序列(脱叶基因)，该基因可被化学处理和放射照射激活。优选核酸序列含有SEQ ID NO2所示的序列。更优选基因被哌嗪(Aziridine)处理和电离辐射所激活。
本发明的第三方面提供了激活棉株脱叶基因的方法，所述方法包括下列步骤用哌嗪和电离辐射处理所述棉株的种子。优选用0.1％v/v哌嗪水溶液将选定的具有所需特征或性状的亲本棉属植物杂交产生的杂种种子处理10小时，接着用20,000伦琴吸收剂量的γ射线放射照射所述种子50秒，优选剂量为4000伦琴。通过将种子暴露于钴60γ射线源，如MPX-γ3以进行适当的放射照射。
本发明的第四方面涉及表现出自动脱叶的棉属植物，负责自动脱叶的基因可被化学和放射照射方法所激活，或者可由亲本植物遗传得到。
优选棉花纤维的颜色选自米色，雪白，棕色和绿色。也优选棉属植物对Thielaviopsis babicola，Fusarium vasinfectum和/或Bemisia tabaci引起的一种或多种病害具有抗性。
在特别优选的实施方案中，植物品种选自本文所述的Rainbow 34，Rainbow39，Rainbow38和Rainbow 37。显然，这些品种的主要特征性差异是棉花纤维的颜色。
整个植株，种子和得自植株的其它可繁殖材料，包括插条和原生质体皆为本发明的一部分。另外，得自棉属植物的产物，包括棉花纤维和由此产生的织物也是本发明的一部分。
另一方面，本发明提供了被本发明的自动脱叶基因转化的棉属植物。具体地说，经基因工程改造的棉株及其生产方法是已知的。Agracetus和Monsanto的研究人员有大量专利和文献出版物描述了转化棉属植物的方法和表达外源蛋白质，如苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的转基因棉属植物。这种转基因的棉属植物已被广泛地用于田间试验，一些棉株已用于商业生产。
为了本说明书的目的，术语“自动脱叶”被理解为指的是在110天至135天的生长周期内，叶从植株的较低区域至较高点自动脱落，此时浇水可延迟生长周期。
约在第110至135天时，棉铃全部张开。
术语“激活”指的是将休眠的脱叶基因转变为其表达或表达产物能使含有此转变基因的植物自动脱叶的基因。激活包括通过突变或除去封闭剂或抑制其活性使休眠基因解封闭。也包括将按上述方式激活的基因遗传下去。
贯穿本说明书的描述部分和权利要求书，“含有”一词指的是包括但不限于，而不排除其它添加剂，组分，整数或步骤。
发明详述仅参照下列非限制性的实施例和图以详细描述本发明，其中
图1包括本发明优选实施方案之植株Rainbow 34(
图1A)和Rainbow39(
图1B)的照片。
图2阐明了与非自动脱叶的比较棉株Sicala-34相比，Rainbow 39在棉铃张开时自动脱叶的方式。
图3显示出Rainbow 39和比较棉株Sicala-34的DNA指纹图。
图4是显示Rainbow 34，Rainbow 39和Sicala-34之单向方差分析结果的方框图。
实施例1产生杂种种子以激活脱叶基因对棉属植物的系谱数据的分析表明最初的亲本品种5476I和7631I的杂交可能在杂种后代中产生了具有高纺绩和技术参数的白色和浅米色纤维。
首先，在每个变种中，使选定原种或P种子经受不少于1000-1500个种子结实率为75％的授粉花相互杂交，F2植株与F3植株杂交。在第二代杂种中，通过播种并对植株进行本领域技术人员所熟悉的子代测验谱系法以选择所需的特征。从异基因复合体中挑选分离的亲缘株，产生具有精确测定之主要特征的后代。具体地说，将对真菌和细菌疾病和害虫的抗性，棉花纤维的颜色用作选择标准。1978至1993年在俄罗斯进行了这一选择计划，1995至1996年，澳大利亚政府与悉尼大学签约执行此选择计划。
使均一的家系杂交以形成新的品种，即俄罗斯技术科学研究院的Fursov教授培育出的“Genetic 1”，该品种于1978年被记载于Turkmenistan棉花选择学会的选择目录中。之所以选择此品种是因为其产生的棉花纤维的技术和纺绩性能。实施例2处理杂种并选择自动脱叶通过暴露于0.1％的哌嗪水溶液10小时以处理按实施例1所述产生的杂种。
所使用的哌嗪水溶液的浓度为0.025-0.05，和0.1-0.4％(v/v)。
使用不同浓度的此诱变剂会导致不同程度的突变。处理后，对突变程度的定量分析和定性分析的结果表明诱变剂对最近选择的品种“young”的作用最大，但杂种的产量也特别高。在诱变剂的水平一定时，基因型越不均一，突变的程度越大。哌嗪的最适浓度为0.1％。
用0.1％的哌嗪处理10小时之后，用钴60γ射线源MPX-γ3以20,000伦琴的剂量对杂种进行γ-放射照射50秒，优选剂量为4000伦琴。用多剂量的γ-放射照射，以-0.25-0.05，-1.0-2.0，-3.0-5.0的水平放射照射棉花种子。10.0-20.0的剂量是半-致死剂量，30.0-60.0的剂量是超致死剂量。然而，在储存中，半致死剂量不是绝对有害的，需仔细观察种子的恢复。
将经处理的种子置于纱布袋中，于室温下储存18个月。
储存18个月之后，将选定家系的种子播种于第三代杂种中，选择原种植株，包括那些表现出自动脱叶之能力的植株，使它们相互杂交。夏天播洒储存的种子，秋天时进行挑选，将每个植株放在各自的袋中。将畸变的百分比测定为因γ-放射照射所致的表型变化，形态修饰，畸形和其它非遗传的新生长的频率。选择并记录因突变所致的表型变异和任何可见的改变之后，将引起各个表型的种子各轧成皮棉，保存为独立的家系以待来年播种。
以下简述了产生本发明之棉属植物的系谱方案F3(7631-I×5476-I)×F2(5476-I×7631-I)然后用0.1％的哌嗪将这些亲代的天然杂种子代处理10小时。从经处理的种群中选择种子以形成种子的M2和M3代。然后从中选择最好的品系进行杂交。实施例3繁殖能产生有色纤维的自动脱叶的棉株；Rainbow系列将按实施例2所述进行处理的最佳种子品系顶交，选择母本形式最为显著的4个棉株。其余棉株被当成父本形式杂交。
通过表型的显性化测定自动脱叶的第一代遗传特征。通过个别选择搜集到所有的特征。在第二代中，测定种群不均一性或可遗传性的系数。多基因性导致第一代杂种中出现显性表型。
使用这一选择方法产生了具有天然白色和浅米色纤维的，完全能自动脱叶的棉花品种，如Rainbow 34[浅米色]和Rainbow 39[白色]。
分别被称为Rainbow 38和Rainbow 37的两个其它的棉株也被选择用于开发。这些品种的特征示于表1。
表1本发明的优选的品系的特征Rainbow 34 Rainbow 38 Rainbow 37形状散布 散布 散布叶密度 中等 中等 中等高度(av.) 中等高度92cm 中等高度60-112cm 中等高度68-105cm节数/枝条(av.) 5-6 2-52-5叶形和大小(av.) 掌形17700mm2掌形15400mm2掌形16080mm2腺/蜜腺 ++ +花瓣色 奶油色 米色 米色纤维色 米色 棕色 绿色棉铃大小(av.) 46mm×32mm 48mm×34mm 50mm×32mm棉铃形 椭圆囊状 椭圆囊状 椭圆囊状棉铃绒纤维的含量高 高 高棉铃绒纤维的颜色奶油色 棕色 绿色纤维长度(av.) 36mm 35mm 35mm纤维细度(av.)单位？ 细3.65 细3.88 细3.80棉铃张开时 94％ 89％ 91％自动脱落棉株Rainbow 34和Rainbow 39的植株示于
图1，Rainbow 39在棉铃张开时失去叶的方式示于图2。
使用本领域现有技术进行获得所需结果所必需的大量试验以再现本发明是可行的。根据布达佩斯条约的规定，于1998年7月2日将Rainbow 39种子的样品保藏于澳大利亚政府分析实验室中，保藏号为NM 98/06259。这些种子也被保藏于悉尼大学的保藏中心，澳大利亚Cobbitty，N.S.W的植物研究和检疫站。
选择白色和突变颜色的，自动脱叶之棉株的方法和限定自动脱叶之方法的一般原理如下第一年为了繁殖最初形式的两种棉花G.hirsutum和G.peruvianum Cav，对后代进行如实施例2所述的处理，选择通过任何特征表现出早期天然脱叶基因型的显性突变体。
第一年期间产生任一最初形式或品种，以使携带所选性状之种子的总数在异源品种群中不少于105-106。将种子用突变剂1，4二重氮乙酰丁烷(bisdiazoacetyl butane)的0.1％(v/v)浓度水溶液处理20分钟，然后以流水冲洗2小时，取一份样品在重度施肥田中按每个洞4-5cm深处3个种子进行播种。4-5cm深处的土壤温度优选12-15℃。预期60cm×20-25cm的试验田含有3株植物或90cm×15cm的试验田含有3株植物。
出苗后，一个洞中只剩下2株植物。出现两片真正的叶子后，进一步减小试验区的密度，使一个洞中只含有一株植物。
在植物生长期间进行测量和发育表型观察，以揭示供体型并将之标记以备后续选择。
在开花期和棉铃成熟期，花、叶、茎绒毛、花粉颜色及棉铃形状的所有形态学变异都于未处理植物的相比较，有任何发现均作记录。
棉铃张开时，经个体选择选出突变的所有克隆形式。对所收集的材料进行分析、轧棉机轧并贮藏直至来年。
第二年第一年的、显示有所需特征的种子经贮藏并于第二年播种，以便选择经减数分裂产生的、相对于未经突变剂处理而正常产生之种子的多个突变。然后进行形态观察和自动脱叶动力学检验。
随时间变化的脱叶百分指数非常重要首先，现象应是可以观察到并明确定性的。
其次，数量指数是任何比较或离散因素分析所必需的。
经个体选择收集所选自动脱叶植株的产物，分析棉铃质量、纤维产量、波长、纤维指数、1000种子质量、米数、长纤维断裂长度、蜿蜒度、光泽、颜色等。贮藏种子直至来年播种。
第三年在第三年培养期间检验所选自动脱叶株和其它供体型之间的稳定性和遗传纯度。遗传的、同源的突变体百分数按所测确定品系。所有这些品系都经过个体选择，并进行文库级定量检验。
第四年及随后诸年对有前景并有竞争力的新品系完成最终研究后，进行综合品系级检验(comprehensive varietal grade test)，对稳定型进行仔细检查以确保所需早期天然脱叶、白色和自然成色纤维等特征得以保留。
这些特征通常经证实在第三个培养年的开始保留了一致性。有了精确的播种日志，品系中任何不明显特征或污染物种的等级均做了标记。然后用表现出的两个优秀特征的随后定级进行育种研究(选择)。排除品质不良的或易受粉虱攻击的品系，并终止对它们的进一步筛选。
留下的植株同时选自最高产品系，并用于检验品系纯度，和用以确保对粉虱危害的持久抗性。
培养最优良育种品系，以人工刺激物为本底进行等级检验和研究。为此，取10份棉铃样品进行复合分析。然后由所选组群提供2.5-3.0kg的纯级种子并冻存以备后用。
棉株脱叶率以两种方法规定1.主茎脱落的叶子(果节叶棱数)对总叶数的比率，包括一定时间内已主茎上已脱落叶子的百分数。
这些比率可以如下公式表示D＝(Cf/F)×100％(一个植株的脱叶)D＝[Cf/(Cf+con f)]×100％在F＝Cf+con f其中D 脱叶Cf叶棱数(来自Latin瘢叶(Latin-cicatris folii)F 总叶数con f 死叶子和保留的叶子棉株自动脱叶最好与棉铃张开和成熟同时发生，而这一特征越早被检测到，就越有商用价值。
自第二代筛选稳定、可早期自动脱叶的优良植株。它们代表显性和隐性突变，这些突变可以是自动脱叶棉株变种的祖先，无需解开对基因的封闭。表现早期天然自动脱叶的植株命名为“Fc”，源自Latin foliumcaolucus(落叶)。
本发明的化学诱变法可对进步型突变进行快速、常规筛选。
此外，有效诱导自动脱叶的最大可能性由与DNA有化学亲和的试剂的化学作用确保。虽然所观察到的优点与任何已知机制均无关，但据信化学物如哌嗪的亲和力连同放射照射处理可逆转对休眠或“跳跃”脱叶基因(显性同隐性一样)的封闭，由此活化之。
使用本领域现有技术进行获得所需结果所必需的大量试验以再现本发明是可行的。
本发明的其它数据示于表2-5。表2Gossipium品种1995“Rainbow 39”与比较者(*)的比较品种名称比较RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均 1305.0 778.00标准差156.99 169.85LSD(0.01)/显著性 120.18 P≤0.01叶形 掌形掌形叶棉子酚腺有 有叶蜜腺有 有花色奶油色 奶油色棉球大小cm3(1)平均 39.90 30.70标准差9.899 6.292LSD(0.01)/显著性 2.674 P≤0.01棉球形椭圆囊状椭圆囊状棉球形状H/W(2)平均 1.8765 1.587标准差0.1618 0.1114LSD(0.01)/显著性 2.674 P≤0.01梗长(mm)平均 11.20 18.50标准差1.8525 2.0283LSD(0.01)/显著性 2.674 P≤0.01纤维颜色白色白色(1)以最老的未开的棉球符合的理论圆锥的体积表示棉球大小(2)以高/宽的比代表棉球形状(*)在检疫温室中表2续Gossipium品种的比较(*＝比较者)RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均 906.70910.4标准差 127.91158.64LSD(0.01)/显著性 47.13 NS叶宽(mm)平均 161.72142.1标准差 21.76 18.53LSD(0.01)/显著性 7.98 P≤0.01叶长(mm)平均 124.72108.10标准差 16.11 14.51LSD(0.01)/显著性 5.35 P≤0.01棉铃高mm平均 52.79 47.45标准差 4.73 5.76LSD(0.01)/显著性 1.97 P≤0.01棉铃形状H/W平均 1.38 1.37标准差 0.095 0.174LSD(0.01)/显著性 0.0486NS梗长(mm)平均 26.24 27.37标准差 5.323 7.15LSD(0.01)/显著性 2.085 NS表2续Gossipium品种的比较(*＝比较者)RAINBOW-39 SICALA-34*绒纤维(％)平均 31.835.98标准差 1.413.71LSD(0.01)/显著性 5.32NS纤维长(ins)平均 1.261.142标准差 0.0182 0.0249LSD(0.01)/显著性 0.0607 P≤0.01纤维强度(g/tex)平均 32.24 46.58标准差 2.512.5094LSD(0.01)/显著性 7.73P≤0.01稳定性特征育种者一代平均值一代平均值平均值同(S)信息 或状态或状态的差异(D)？脱落是是是 S叶形成 掌形 掌形 掌形S叶棉子酚腺 有有有 S叶蜜腺 有有有 S花色奶油色奶油色奶油色 S棉铃形 椭圆囊状 椭圆囊状 椭圆囊状S绒纤维色白色 白色 白色 S表2续一致性-异花传粉种以下方差比作为一致性的证据特征 新品种的方差 参比品种的方差新/参比的比‘Rainbow-39’ ‘Sicala’植株高安街16360 25090 0.65棉铃长22.28 33.18 0.67棉铃形9.025-030.029 0.31梗长 28.3 51.12 0.55绒纤维％ 0.74 4.88 0.15纤维长3.31-046.2-040.53表3Gossipium品种1995“Rainbow 39”的比较品种名称 比较RAINBOW-39 SICALA-34*植株高度(mm)平均906.70 910.4标准差 127.91 158.64LSD(0.01)/显著性47.134 NS叶大小cm2(1)平均101.44 77.93标准差 26.008 18.904LSD(0.01)/显著性8.61 P≤0.01叶形掌形 掌形叶形H/W(2)平均1.31 1.33标准差 0.1022 0.1551LSD(0.05)/显著性1.968 NS叶棉子酚腺 有 有叶蜜腺 有 有花色 奶油色 奶油色棉球大小cm3(1)平均62.855 47.092标准差 15.842 11.713LSD(0.01)/显著性2.593 P≤0.01棉球形 椭圆囊状 椭圆囊状棉球形状H/W(4)平均1.3818 1.3610标准差 0.0948 0.1726LSD(0.01)/显著性2.593 NS表3续梗长(mm)平均 26.24 27.25标准差5.3227 7.0559LSD(0.01)/显著性 2.593 NS纤维颜色白色 白色(1)以最老的叶的高和宽所成的三角形面积测定叶的大小(2)宽/高的比代表叶的形状(3)以最老的未开的棉球符合的理论圆锥的体积表示棉球大小(4)以高/宽的比代表棉球形状纤维细度值平均 2.67 3.52标准差 0.11 0.38LSD(0.01)/显著性 0.15 P≤0.01纤维延伸(％)平均 5.9 6.14标准差 0.51 0.055LSD(0.01)/显著性 0.864NS纤维一致性指数(％)平均 89.2687.8标准差 1.17 1.15LSD(0.01)/显著性 3.24 NS表3续个别特征叶形 掌形掌形叶棉子酚腺有 有叶蜜腺有 有花色 奶油色 奶油色棉铃形椭圆囊状椭圆囊状纤维色白色白色一致性-异花传粉种以下方差比作为一致性的证据特征 新品种的方差 参比品种的方差 新/参比的比‘Rainbow-39’‘Sicala-34’植株高度16360.97 25166.65 0.65叶形0.01 0.0240.42棉球形 8.98704-030.03 0.31梗长28.3349.790.57STATTISTIC 4.1单向AOVR34 R39 SIC来源 DF SS MS F P间2 34719.0 17359.531.45 0.0000内297 1.639E+05551.927总299 1.986E+05CHI-SQ DFP等偏差的BARTLETE ------ -------------检测 11.012 0.0041COCHRAN Q 0.4085最大VAR/最小VAR 1.8928组间偏差的成分168.076有效的CELL大小100.0变量 平均 样本大小 组间标准差R34100.00 10024.941R39101.44 10026.008SIC77.932 10018.904总 93.123 30023.493300例丢失0例表4续STATTISTIC 4.1LSD(T)平均值的配对比较变量 平均值 同类组R39 101.44 IR34 100.00 ISIC 77.932 ..I有两组中的平均值与另一组的无显著差异临界T值 2.592 干扰水0.010比较的临界值 8.6133比较的标准差 3.3224
表4续STATTISTIC 4.1描述统计R34R39 SICN 100100 100丢失 0 00总和 1.000E+04 1.014E+047793.2LO 95％CI 95.054 96.275 74.181平均值 100.00 101.44 77.932UP 95％CI 104.95 106.60 81.683SD 24.941 26.008 18.904SE平均值 2.4941 25.640 24.257C.V. 24.940 25.640 24.257最小 51.920 51.300 43.6101ST QUARTI 84.025 83.585 64.190中值 94.400 99.120 78.1003RD QUARTI 109.20 111.24 91.412最大 183.06 222.00 131.95MAD11.800 13.650 13.845偏差 615.81 669.63 353.78偏移 1.0511 1.6782 0.3960峰值 1.3222 5.0449 -0.2032
表5Gossypium hirsutum‘Rainbow-39’异名‘Genetic 39’说明植株散布；中等高度；密叶；结果枝长。叶；带有短柔毛的中脉的掌形并且有棉子酚腺和蜜腺并且在成熟时脱落。花奶油色。棉铃是带有26.24mm的梗的椭圆囊壮。纤维长在“鲨皮法”测定时为1.26英寸。纤维一致性指数89.26％，延长5.9％，强度32.24g/tex而细度值为2.7。
起源通过辐射育种系‘Turkmenistan Genetic 1’的种子诱发突变。育种者V.N.Fursov，Ashgabat，Turkmenistan教授。在下文中，用世代谱系法选择早熟的带有长纤维的自落叶植株直到建立稳定的品种。
比较实验比较者Sicala-34。1994/95在Rydalmere的国家检疫站的温室中，1995/96在Sydney大学，植物育种所，Narrabri进行。测量值来自重复四次的随机安排的完全区组的实验中随机选择的95个植株。纤维质量数据来自通过“鲨皮法”的绒纤维，测试重复5次。温室生长的植株也呈现出长纤维。
适应性‘Rainbow-39’可在棉花可生产的任何地区生长。
实施例4 其它实施方案种间杂种-以前在F1中-用5种浓度的哌嗪水溶液处理，连同对照品种一起播种于0.25公顷的试验田中。
然后在实验室的试验中培养新获得的品种的育种株/后代F3-Chem3，对最佳突变品系用顶交法重新授粉，每个白色或米色基因型还带有100％自动脱叶特征。
为限定F1中项交的脱叶性状的遗传特征而测定表型显性度P。
这些F1杂种显示，当与所选最优自动脱叶突变品系杂交时，最初形式的自动脱叶特征具有显性，培育出本文命名为“BD”的品种，作为筛选方法的产物。
在F2中，限定了杂种之自动脱叶特征的遗传可能性。突变后代中和杂种F2-F3代群体中的不均匀程度可用遗传可变性或由Allard公式计算的遗传能力系数确定，公式如下h2 任一特征的遗传能力系数G2 P1 第一亲代离散性G2 F1 杂种F1代离散性G2 P2 第二亲代离散性G2 F2 杂种F2代离散性h2=G2F2-G2F1+G2P1+G2P23G2F2]]>实施例5Rainbow 39的DNA指纹图由政府分析实验室的分子生物学实验室按合同在DNA指纹图试验中比较了Rainbow 39的DNA提取物与Sicala-34(比较株)的DNA。
从两株Gossypium hirsutum品种(Rainbow 30和Sicala 34)中以鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA样品。CTAB是破坏细胞壁与核酸形成复合体的一种去污剂。CTAB-核酸复合体随后可从碳水化合物中纯化并分离(Brian等1994，Scott等1994)。将CTAB提取的DNA再进一步纯化以去除DNA聚合酶抑制物。首先，向CTAB提取液中加入聚吡咯烷酮乙烯(PVP)。PVP可促进多酚和其它有机物质的沉淀(Kim等，1997)。其次，将所得DNA沉淀团用市售DNA纯化基质InstaGene MatrixTM(BIO-RAD)温育。此基于树脂的基质能有效吸附干扰PCR扩增过程的细胞裂解产物。结果显示，用按照这一新方法提取的棉株DNA获得了令人满意的PCR扩增。从40个随机选择的10体引物筛选出用于产生DNA指纹图的合适10体引物。
产生棉株的DNA指纹图需要大量的基因组DNA。因此需用新鲜幼龄叶片组织提取DNA。不新鲜的棉株叶片组织DNA水平极低，而多酚和其它抑制物的水平很高。
提取的DNA用随机扩增的多形性DNA聚合酶链式反应(RAPD PCR)技术分析。
RAINBOW 39和SICALA 34的DNA指纹图显示，有三个引物单独使用后产生的RAINBOW 39和SICALA 34指纹图具有显著性差异，而大多数引物产生的指纹图相同。这说明RAINBOW 39和SICALA 34是密切相关的棉花品种。但如图3所示，有一个引物(引物z11)产生的RAINBOW 39和SICALA 34的指纹图具有可遗传的差异。用引物z11产生的DNA指纹图凝胶分布图显示RAINBOW 39和SICALA 34之间有不同的RAPD PCR表现(第四泳道和第六泳道)。DNA大小用DNA standard GENESCAN-2500指示。
获得DNA指纹图的方案详述如下从Gossypium hirsutum中提取基因组DNA脱氧核糖核酸(DNA)从新鲜幼龄棉株叶片中经下述方案提取。
(1)250mg棉株组织在研钵中与20μl 2-巯基乙醇(SIGMA，M-3148)一起研磨直至植物组织具有乳脂状稠度。
(2)600μl 2X提取液加入组织中，继续研磨直至组织溶液变清亮(2X提取液2.0％鲸蜡基三甲基溴化铵，1.4M NaCl，100mMTris-HCl pH 8.0，20mM乙二胺四乙酸，1.0％聚吡咯烷酮乙烯)。
(3)将组织液转移至1.5ml微管中，于65℃温育5分钟。
(4)向组织液中加入600μl氯仿/异戊醇(24∶1)，用涡流混合器彻底混合以形成乳液。然后将微管在10,000xg离心5分钟。
(5)将上层水相中的溶液转移至新微管，每管含600μl异丙醇，颠倒混合直至白线样DNA链形成可见的团块。
(6)将微管冰浴10分钟，于5,000xg离心2分钟。
(7)用移液管去除上清。
(8)加入400μl高盐TE缓冲液于65℃温育10分钟使DNA裂解(高盐TE缓冲液10mM Tris-HCl pH 8.0，1.0mM乙二胺四乙酸pH 8.0，1.0M NaCl)。
(9)加入800μl无水乙醇使DNA沉淀，颠倒混合直至线样DNA链形成可见团块。
(10)将微管冰浴10分钟，于5,000xg离心2分钟。
(11)用移液管去除上清。
(12)室温下使微管敞于空气中1小时使DNA沉淀干燥。
(13)加入200μl 10％(w/v)Chelex100树脂(BIO-RAD)的TE液并于55℃温育30分钟使DNA重新裂解。(TE缓冲液10mMTris-HCl pH 8.0，1.0mM乙二胺四乙酸pH 8.0)。
(14)重新裂解的DNA溶液于12,000xg离心10分钟。
(15)将DNA上清转移至新的微管。
(16)树脂沉淀悬浮于200μl TE缓冲液，室温放置20放置。然后重复第(14)和第(15)步。
(17)核糖核酸(RNA)从DNA溶液中去除的方式是向微管中加入2μl Rnase(20mg/ml)并于37℃温育30分钟。
(18)用溴乙锭荧光定量法测量DNA浓度和量。
(19)此时的DNA可用于RAPD PCR分析或贮于4℃。用随机扩增的多形性DNA聚合酶链式反应(RAPD PCR)产生DNA指纹图本方案用随机扩增的多形性DNA聚合酶链式反应(RAPD PCR)技术产生DNA指纹图，其中用到一个任意序列的10体寡聚核苷酸引物来扩增棉属植物Gossypium hirsutum品种(RAINBOW 39和SICALA 34)的基因组DNA。用GeneScan 672软件分析RAPD PCR产物。(i)RAPD PCR过程RAPD PCR在25μl体积中进行，其中有近25ng棉属植物基因组DNA，100pM单一10体引物z115｀-CTCAGTCGCA-3｀(SEQ ID NO1)2.0mM MgCl2，10mM Tris-HCl，，pH 8.3，16.6mM(NH4)2SO4，100μg/ml明胶，0.45％Triton-X100，100μM dATP，100μM dCTP，100μM dGTP，100μM dTTP，0.1μM dUTP，1.0单位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。反应在0.5ml的覆盖有矿物油的微管中进行。在预热至95℃的热循环仪(HYBAID，OmniGene，U.K.)中循环。共执行45个循环，每个循环为94℃1分钟，36℃1分钟和72℃2分钟，分别用于DNA变性、引物退火和引物延伸。PCR产物贮于-20℃。(ii)RAPD PCR产生的DNA指纹图用AB1 GeneScan 672软件在DNA测序仪373系统上分析。
电泳条件用9ml 40％丙烯酰胺N，N｀-甲叉-双-丙烯酰胺＝19∶1贮存液(BIO-RAD)、16ml 5x TBE缓冲液(5x TBE缓冲液1升54gTris碱基，27.5g硼酸，20ml 0.5M乙二胺四乙酸pH 8.0)、55ml蒸馏水、400μl 10％过硫酸铵、45μl N，N，N｀，N｀-四-甲基-乙二胺配制4.5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液。
缓冲液为1x TBE(280ml 5x TBE缓冲液，1120ml蒸馏水)。于700v电压下电泳18小时。RAPD PCR产物用蒸馏水稀释为1∶10。1μ稀释的产物与1μ内道DNA大小标准GeneScan-2500 ROX和3μl加样液混合(AB1 GeneScan试剂盒)。混合样品再上样于上述凝胶。DNA指纹图结果可由Ab1 373自动DNA测序仪用GeneScan 672软件自动分析并报道，见图3。
实施例6 对Rainbow 39测序用下述多形性随机扩增的DNA聚合酶链式反应(RAPD PCR)从棉属植物Gossypium hirsutum品种(Rainbow 39)中扩增得到一个227bp的基因组DNA片段。该DNA片段不是用该试验从另一个非自动脱叶棉属植物品种(Sicala 34)中扩增出来的。将227bp DNA片段克隆进一个质粒载体并用ABI 373自动DNA测序仪测序。测出片段的DNA序列，示于SEQ ID NO2。
实验方案1.用随机扩增的多形性DNA(RAPD)试验进行PCR对棉属植物Rainbow 39和Sicala 34品种的基因组DNA进行RAPD-PCR反应。每个扩增反应在25μl体积中进行，其中有近25ng基因组DNA，25ng单一10体引物，2.0mM MgCl2，10mM Tris-HCl，，pH8.3，16.6mM(NH4)2SO4，100μg/ml明胶，0.45％Triton-X100，100μM各种dNTP，1.0单位Taq DNA聚合酶。反应在0.5ml的覆盖有矿物油的微管中进行。共扩增45个循环，每个循环在热循环仪(HYBAID，OmniGene，U.K.)上分别用94℃1分钟，36℃1分钟和72℃2分钟进行DNA变性、退火和引物延伸。每次进行RAPD PCR时均包括空白对照(PCR反应中未加DNA而以水代替)。PCR产物的分析是在1.4％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴乙锭染色显示并照相。
2.RAPD PCR片段的纯化DNA带在1.2％的低熔点琼脂糖凝胶上分离，用溴乙锭染色，从凝胶上切下所需片段。将这段切出的含DNA片段的凝胶放入1.5ml Eppendorf管中，以TE缓冲液覆盖，然后在70℃加热15分钟熔化凝胶。熔化好的凝胶溶液用苯酚/氯仿抽提，再用氯仿抽提。加入0.1体积的3M醋酸钠和1体积的异丙醇在-20℃放置过夜以沉淀DNA。在10,000g离心15分钟收集DNA，重新悬浮于无菌水中。DNA浓度通过在有量化DNA分子大小标准物的凝胶上电泳测量。
3.DNA克隆(a)连接pGEM-T载体(Promega)也用于克隆PCR带。按厂商建议将PCR产物用这些载体连接。
(b)转化将10％的连接反应物，或5ng未切断的对照载体，与100？感受态细胞在Eppendorf管中混合，冰浴1小时。于42℃水浴中加热振荡Eppendorf管2分钟，然后冰浴20分钟。接着加入1ml LB至管中，细胞在垂直旋转轮上于37℃温育30-40分钟。用微量离心管在1,500g离心10分钟收集细菌细胞，重新悬浮于含30mg/ml X-gal和20mg/ml IPTG的200？LB中。将细菌溶液涂布于含100？/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37℃烘箱中干燥2小时，然后将琼脂平板在37℃倒置培养过夜。
(c)重组克隆子的筛选含重组载体的细菌菌落为白色，不含重组载体的为蓝色。选出5个白色菌落进行下述质粒制备。切下的插入子和载体随后在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳分离。对照插入子和线性载体DNA也在同一凝胶上电泳。正确的重组质粒因既有插入子又有载体带而得到鉴定。
1.制备进行DNA测序用的质粒DNA大肠杆菌菌株JM109的转化单菌落在含10？/ml氨苄青霉素的5ml LB肉汤中于37℃振荡培养过夜(约16小时)。三份样品按每份1.5ml在1.5ml Eppendorf管中于1,500g微量离心10分钟以沉淀。将大肠杆菌沉淀彻底悬浮于200？GET缓冲液(50mM葡萄糖/25Mm EDTA/20MmTris-HCl，pH8.0)，接着在1,500g离心10分钟。将大肠杆菌沉淀悬浮于含10mg/ml溶菌酶的50？GET中。冰浴30分钟后，加入150？0.5MNaOH/1.0％SDS裂解大肠杆菌。蛋白质和基因组DNA因加入200？3M醋酸钾pH 5.2而沉淀。将上清转移至新的Eppendorf管。然后质粒因加入等体积异丙醇并在10,000g离心10分钟而沉淀。质粒沉淀经70％乙醇漂洗，风干1小时。质粒DNA溶于含10？/ml Rnase的200？TE缓冲液中，37℃温育1小时。DNA溶液用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提两次。质粒DNA然后因加入0.1体积的3M醋酸钠pH 5.2和2.5体积的无水乙醇而沉淀。冰浴30分钟后，质粒DNA在10,000g离心10分钟。DNA沉淀用70％乙醇漂洗并按上述风干。质粒DNA最后溶于50？水中，-20℃贮存。
2.DNA测序在ABI自动DNA测序仪(373型，UAS)上用AmpliTaq DNA聚合酶染料终止物循环测序试剂盒按Perdin Elmer建议的条件进行双脱氧链终止测序。用ABI测序分析软件得到DNA序列的数据。
本发明的优选实施方案在一个优选实施方案中，本发明的棉属植物是名为“BD”的品种，它有雪白的棉花纤维，在生长末期表现自动脱叶。
此品种表现为合轴分枝，为锥形灌木，有0-2个高达100-110cm的单轴灌木，棉铃重约5.5g。该灌木产量很高、抗倒伏、被绒毛且茎上的晒斑到秋季加重。叶子均为柔和的淡绿色，分3-5瓣。花为五角形、中等大小、不含花色素斑点。天然纤维为白色、色泽鲜艳或略带淡点，均紧裹在棉铃中不会掉出，适于用手或机器采摘。
纤维产量达34-36％，长36/38mm。
至生长期末，脱叶达100％。该植物顶部易干，变成某种“自动凸起”的植物。
白色和有色纤维均不受日光影响。
纤维对生态有利，即其表面不含毒素，而且该品种有95-100％早期天然自动脱叶。
本发明经此详细描述已明确并得到理解。本领域技术人员可在不脱离本发明的范围的前提下实施其它形式和实施方案。
本文引用的参考文献列在下一页，并借此引入本文。
参考文献1.Kim SC等(1997)核酸研究251085-1086。
2.Brian H等(1994)植物分子生物学和生物技术中的方法第37-47页。
3.Scott O等(1994)植物分子生物学手册D11-8。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A) 姓名Virgin Cotton Company Pty Ltd(B) 街名1 Percival Road(C) 城市Stanmore(D) 州名NSW(E) 国家澳大利亚(F) 邮编2048(i)发明题目自动脱叶的植物(ii)序列数2(iii)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(i)当前申请信息申请号AU P08174(1)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(i)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“PCR引物”(ii)假设有(iii)反义无(iv)片段类型N-末端(v)来源(A)生物体Gossypium hirsutum(B)植株RAINBOW 39(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCAGTCGCA10(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度227个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(iv)反义无(v)片段类型内在(vi)来源(A)生物体Gossypium hirsutum(B)植株RAINBOW 39(C)组织链型叶(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCTAAAATG CAGGAGGACC AGAACTAACT CAACGCCACT CAACACTATACCTCGGATCC 60CACAGGAGCC CTGGCTTGTC CCTCTGTGCT CACTCATCCT TTCCCGTGTCGTTAACTAAT 120GTCTGCCTAC AGGAGGGAGT TGTTGCAGTC AAGGGAAATG ATCCCTAAAATTCTCTACGC 180TGCACCATTC CCCGATCAAG ACCATGTGAT TCATGAAAAT TATAACA22权利要求
1.一种自动脱叶棉属植物。
2.权利要求1的植物，其中该棉属植物含有经激活后可影响此棉属植物自动脱叶的核酸序列或其功能性片段。
3.权利要求2的棉属植物，其中该核酸序列由化学处理和放射照射激活。
4.权利要求3的植物，其中该核酸序列用哌嗪处理和电离辐射激活。
5.权利要求2-4之任一项的植物，其中该核酸序列或其片段含有SEQ IDNO1所示序列。
6.权利要求5的植物，其中该序列为SEQ ID NO2所示序列的功能性片段。
7.权利要求1-6中任一项的植物，其中该棉属植物为Gossypium hirsutum植株的。
8.权利要求1的植物，其中该植物选自Rainbow 34，Rainbow 39，Rainbow38和Rainbow 37组成的组合。
9.权利要求1-8中任一项的植物，其中该植物在棉铃张开时自动脱叶。
10.权利要求2的植物，其中该植物的种子具有AGAL保藏号NM 98/06259的生物学特性。
11.权利要求2的棉属植物，具有选自米色、雪白、棕色和绿色之组合的棉花纤维颜色。
12.权利要求11的棉属植物，其中该植物可抵抗由Thielaviopsisbabicola、Fusarium vasinfectum和/或Bemisia tabaci所致的一种或多种疾病。
13.权利要求12的棉属植物，其中该植物含有经激活后可影响此棉属植物自动脱叶的核酸序列或其功能性片段。
14.已用赋予了自动脱叶能力的核酸序列转化、并含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的棉属植物。
15.权利要求1-14中任一项之植物的后代或其衍生的棉属植物，可自动脱叶，附带条件是此后代不是本文所述Rainbow 34或Rainbow 39。
16.激活棉属植物中脱叶核酸序列的方法，步骤包括用哌嗪和电离辐射处理棉属植物的种子。
17.权利要求16的方法，其中这些种子均为杂交种子，产自经筛选携带所需特征或性状的亲代棉属植物的杂交，且这些种子均用哌嗪处理了10小时随后以约20,000伦琴的吸收剂量进行了γ-射线照射。
18.权利要求17的方法，其中γ-射线照射的剂量为4,000伦琴，50秒。
19.权利要求18的方法，其中这些种子含有带SEQ ID NO2之DNA片段的核酸序列或其功能性片段。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中这些种子具有AGAL保藏号NM98/06259的生物学特性。
21.含有与SEQ ID NO2所示序列相关的序列，并且当在棉属植物中存在时具有自动脱叶的能力的核酸分子。
22.权利要求21的核酸分子，其中该相关序列表达在棉属植物中。
23.含有权利要求21或22的核酸序列的载体或质粒。
24.含有权利要求21或22的核酸序列的植物细胞。
25.含有权利要求24的植物细胞的植物。
26.权利要求1-15、权利要求24或25中任一项之棉属植物的产物，选自下组可繁殖材料、种子、插条、幼苗、原生质体、叶、茎、花、棉花纤维和织物。
全文摘要
本发明涉及自动脱叶的棉属植物,以及其后代、可繁殖材料、种子、插条、幼苗、原生质体、叶、茎、花、和棉花。还涉及用这样的植物的棉花生产的纤维和织物,以及含有与自动脱叶特征有关的序列的核酸分子。
文档编号A01H1/06GK1270496SQ98809091
公开日2000年10月18日 申请日期1998年7月20日 优先权日1997年7月22日
发明者维克特·弗索夫, 卡米拉·哈尔曼 申请人:纯棉有限公司