本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种铁皮石斛离体培养再生植株的方法。
背景技术：
铁皮石斛是兰科草本植物，生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，主要分布于中国安徽、浙江、福建等地；其茎入药，属补益药中的补阴药；益胃生津，滋阴清热。
组织培养已在兰花生产中广泛使用，并且不断有改进的技术和新方法推出。直接以组织培养物替代使用原药材或者生产活性成分也是解决石斛资源短缺的方法之一，但目前涉及到该方面的研究还很少。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种铁皮石斛离体培养再生植株的方法，本发明解决的技术问题是提供一种铁皮石斛离体培养再生植株的方法。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
这种铁皮石斛离体培养再生植株的方法依次包括外植体前预理、愈伤组织培养、不定芽培养、壮苗培养，壮苗培养之后进行不定根培养；
外植体为新鲜、无病害的铁皮石斛叶子；
不定根培养的培养基为含有5克/升～10克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升肌醇、10克/升～20克/升腺嘌呤、50毫克/升～100毫克/升水解酪蛋白和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培养基。
上述铁皮石斛离体培养再生植株的方法技术方案中，更具体的技术方案还可以是：愈伤组织培养的培养基为含有1.5mg/l～2mg/l2，4-d、20mg/l～32mg/lga、1.0mg/l～1.2mg/l6-ba和30g/l～50g/l的蔗糖的ms培养基。
进一步的，愈伤组织培养的温度为23℃～26℃，光照度为1200～1500lx。
进一步的，不定芽培养培养过程中采用的培养基为含有100g/l～150g/l苹果汁和2mg/l～3mg/l萘乙酸的ms培养基。
进一步的，不定芽培养、壮苗培养和不定根培养过程中的温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx。
进一步的，壮苗培养过程中的壮苗培养基为含有添加5克/升～15克/升萘乙酸、5克/升～10克/升的硝酸钾和36克/升～50克/升蛋白胨的ms培养基。
更进一步的，生根培养过程中的生根培养基为含有10克/升～20克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升葡萄糖和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培养基。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
1、本发明以铁皮石斛叶子作为外植体，在不定芽培养和壮苗培养之后进行不定根培养，不定根培养的培养基为含有5克/升～10克/升吲哚乙酸、80克/升～100克/升肌醇、10克/升～20克/升腺嘌呤、50毫克/升～100毫克/升水解酪蛋白和8克/升～14克/升萘乙酸的ms培养基，与现有的铁皮石斛组织培养方法相比，本发明出根量大，生根效果好。
2、本发明壮苗培养基中添加硝酸钾，钾元素的加入能够有效抑制铁皮石斛植株褐变。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述：
实施例1
本实施例采用新鲜、无病害的铁皮石斛叶子作为外植体，采用75%的酒精消毒；然后转入愈伤组织培养基中，设置温度为愈伤组织培养的温度为23℃～26℃，光照度为1200～1500lx，培养15天；然后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养10天；再转入壮苗培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养13天；最后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养10天。
本实施例愈伤组织培养的培养基为含有1.5mg/l2，4-d、20mg/lga、1.0mg/l6-ba和40g/l的蔗糖的ms培养基。
本实施例不定根培养的培养基为含有7克/升吲哚乙酸、80克/升肌醇、17克/升腺嘌呤、100毫克/升水解酪蛋白和8克/升萘乙酸的ms培养基。
本实施例壮苗培养过程中的壮苗培养基为含有添加5克/升萘乙酸、10克/升的硝酸钾和50克/升蛋白胨的ms培养基
本实施例不定芽培养培养过程中采用的培养基为含有150g/l苹果汁和2mg/l萘乙酸的ms培养基。
实施例2
本实施例采用新鲜、无病害的铁皮石斛叶子作为外植体，采用75%的酒精消毒；然后转入愈伤组织培养基中，设置温度为愈伤组织培养的温度为23℃～26℃，光照度为1200～1500lx，培养17天；然后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养13天；再转入壮苗培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养18天；最后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养15天。
本实施例愈伤组织培养的培养基为含有1.65mg/l2，4-d、27mg/lga、1.1mg/l6-ba和30g/l的蔗糖的ms培养基。
本实施例不定根培养的培养基为含有10克/升吲哚乙酸、90克/升肌醇、20克/升腺嘌呤、80毫克/升水解酪蛋白和11克/升萘乙酸的ms培养基。
本实施例壮苗培养过程中的壮苗培养基为含有添加8克/升萘乙酸、5克/升的硝酸钾和42克/升蛋白胨的ms培养基
本实施例不定芽培养培养过程中采用的培养基为含有120g/l苹果汁和2.4mg/l萘乙酸的ms培养基。
实施例3
本实施例采用新鲜、无病害的铁皮石斛叶子作为外植体，采用75%的酒精消毒；然后转入愈伤组织培养基中，设置温度为愈伤组织培养的温度为23℃～26℃，光照度为1200～1500lx，培养20天；然后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养16天；再转入壮苗培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养15天；最后转入生根培养基中，设置温度为26℃～28℃，光照度为1400～1700lx，培养13天。
本实施例愈伤组织培养的培养基为含有2mg/l2，4-d、32mg/lga、1.2mg/l6-ba和50g/l的蔗糖的ms培养基。
本实施例不定根培养的培养基为含有5克/升吲哚乙酸、100克/升肌醇、10克/升腺嘌呤、50毫克/升水解酪蛋白和14克/升萘乙酸的ms培养基。
本实施例壮苗培养过程中的壮苗培养基为含有添加15克/升萘乙酸、8克/升的硝酸钾和36克/升蛋白胨的ms培养基
本实施例不定芽培养培养过程中采用的培养基为含有100g/l苹果汁和3mg/l萘乙酸的ms培养基。