一种干巴菌菌种的分离培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种干巴菌菌种的分离培养方法，包括采样、表面灭菌、分离及纯培养步骤，具体包括：在云南松林地中选择幼嫩的干巴菌子实体进行采样并进行保藏；将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理；切取干巴菌子实体置入干巴菌组织分离培养基的培养基平面或试管斜面中，培养，再接种至干巴菌固体培养基的培养基平面或试管斜面中，培养得到目标物，移入含有针叶林废弃物做培养基质的干巴菌菌种培养基的试管斜面保存。本发明是选用野生干巴菌的幼嫩子实体活体，在云南松生长干巴菌的林地现场采集，迅速组织分离，用松树皮、松木屑、松毛等针叶林废弃物做培养基质培养得到，得到的干巴菌菌种繁殖稳定性好、成活率达99.9%以上且长势良好。
【专利说明】一种干巴菌菌种的分罔培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于菌种培养【技术领域】，具体涉及一种干巴菌菌种的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]干巴菌(Thelephota.ganbajun.Zang)属担子菌亚门层菌纲非裙菌目革菌科革菌属的大型真菌，其子实体丛生，呈珊瑚状多次分枝。野生干巴菌是云南滇中特有的珍稀野生食用菌，属于与松树共生的外生菌根菌。科学研究记载，干巴菌干品含粗蛋白24.15%，粗纤维8.45%，总糖量3.1%，10g含维生素Cl.1Omg,维生素A16.0mg，B族维生素1.2mg,维生素E45.14 mg;含有18种氨基酸和人体必需的8种氨基酸，其比值为55%，是优质的蛋白质；干巴菌中含有的多种微量元素铁、钾、钠、磷、锌、镁、铜、锰、钙，特别是人体普遍缺乏的硒元素，其含量高达4603.59Pg/100g，属于罕见的富硒珍贵野生菌；同时，干巴菌的香气挥发油有49种成分，量较大的是亚油酸甲酯；近年来，研究新发现在干巴菌中还含有高度抗氧化活性的对联三苯系列色素，而抗氧化物质能清除人体内的自由基，具有延缓衰老的功效。硒是联合国卫生组织确定的唯一的防癌抗癌元素，适量的硒几乎能防止一切癌变，并能防止人体的四十多种疾病。因此，干巴菌除了是美味野生菌外，其更具有保健和膳食补充价值。近十年来，人们试图用人工栽培技术培育干巴菌，但除了一些试验性报导外，至今仍未实现人工化栽培。本发明的目的就是解决在野生干巴菌资源日趋稀缺现状下，利用人工培育的干巴菌菌种的干巴菌菌丝及扩繁技术，将有效的增加野外干巴菌菌丝数量并保护野生干巴菌的资源。
[0003]由于野生干巴菌是云南特有的珍稀野生食用菌，尤以生长在滇中的云南松森林里面的味道最佳，由于属于外生菌根菌，很难实现人工栽培，虽然目前存在一些人工栽培的方法，均存在成活率低、不能保证菌种栽培繁殖的稳定性等等问题，因此，开发一种能解决上述技术问题的干巴菌分离培养方法是非常必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种干巴菌菌种的分离培养方法。
[0005]本发明的目的是这样实现的，包括采样、表面灭菌、分离及纯培养步骤，具体包括:
A、采样:在云南松林地中选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样并进行保藏；
B、表面灭菌:将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理；
C、分离及纯培养:从灭菌处理后的干巴菌子实体掰开，切取0.Γ0.2cm的干巴菌子实体置入由马铃薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、琼脂2(T30g、蛋白胨5?7g、松树皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氢钾2?4g、硫酸镁4?6g制备得到的干巴菌组织分离培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养36?72h，再接种至由棉籽壳或荞籽4(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麸皮(Tl5g、石膏粉0.5^1.5g制备得到的干巴菌固体培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养6?8天得到目标物，移入干巴菌固体培养基的试管斜面保存。
[0006]本发明是选用野生干巴菌的幼嫩子实体活体，在云南松生长干巴菌的林地现场采集，迅速组织分离，用松树皮、松木屑、松毛等针叶林废弃物做培养基质培养得到，得到的干巴菌菌种繁殖稳定性好、成活率达99.9%以上且长势良好。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为本发明实施例1制备得到的干巴菌长势示意图；
图2为本发明实施例2制备得到的干巴菌长势示意图；
图3为本发明实施例3制备得到的干巴菌长势示意图。
【具体实施方式】
[0008]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0009]本发明所述干巴菌菌种的分离培养方法，包括采样、表面灭菌、分离及纯培养步骤，具体包括:
A、采样:在云南松林地中选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样并进行保藏；
B、表面灭菌:将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理；
C、分离及纯培养:从灭菌处理后的干巴菌子实体掰开，切取0.Γ0.2cm的干巴菌子实体置入由马铃薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、琼脂2(T30g、蛋白胨5?7g、松树皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氢钾2?4g、硫酸镁4?6g制备得到的干巴菌组织分离培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养36?72h，再接种至由棉籽壳或荞籽(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麸皮(Tl5g、包谷芯和/或包谷面(T40g、石膏粉0.5?1.5g制备得到的干巴菌固体培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养6?8天得到目标物，移入干巴菌固体培养基的试管斜面保存。
[0010]A步骤中所述的保藏为密封(T4°C低温保藏。
[0011]A步骤所述的保藏的时间为8?24h。
[0012]B步骤中所述的表面灭菌处理是用65?75%的酒精进行表面消毒灭菌处理。
[0013]C步骤中所述的干巴菌组织分离培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂25g、蛋白胨6g、松树皮和/或松毛50g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁5g制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下:
A、前处理:将马铃薯洗净去皮，按配方比例称取，切成0.Γ0.6cm片，加固液体积比f 3倍的水于95?110°C煮Γ6π?η，，用双层纱布过滤得到滤液a ;按配方比例称取松树皮和/或松毛，加固液体积比2飞倍的水于95?100°C下熬煮r1min，过滤，得到滤液b ；
B、配制:合并滤液a和滤液b，于95?110°C下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌30?40min制备得到。
[0014]C步骤中所述的干巴菌固体培养基由棉籽壳50g、松木屑35g、麸皮14g和石膏粉Ig制备得到，PH值为6.5^7.5，其制备方法如下:
A、前处理:按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比2?4倍的水于2(T26°C下浸泡18?30h，过滤，得到滤液c ;
B、配制:在滤液c中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为60?65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl40min制备得到。
[0015]C步骤中所述的干巴菌固体培养基由松木屑30g、松毛20g、麸皮10g、包谷芯30g、包谷面9g和石膏粉Ig制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下:
A、前处理:按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比2?3倍的水于2(T26°C下浸泡24?48h，过滤得到滤液d;
B、配制:在滤液d中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为60?65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl40min制备得到。
[0016]C步骤中所述的干巴菌固体培养基由荞籽70g、松木屑29g和石膏粉Ig制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下:
A、前处理:按配方比例称取荞籽，加入固液体积比2?3倍的水于2(T26°C下浸泡40?72h，过滤得到滤液e;
B、配制:在滤液e中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为60飞5%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl50min制备得到。
[0017]干巴菌的鉴别特征:
1、干巴菌子实体生长是一层一层向外生长；
2、干巴菌菌丝体10天后，一波一波或一圈一圈的干巴菌菌丝体中间出现黑色分泌物，培养时间越长，白色菌丝苔越厚，分泌的黑色素越深；
3、干巴菌菌丝是适应生长在含有松树皮汁的培养基中，且菌丝长势旺，菌丝白，用松木屑、松毛、松树汁液及针叶林废弃物作培养基质培养干巴菌，长势强，菌丝体一波一波、一圈一圈的向下生长，20多天后分泌黑色素。
[0018]注:在人工培养的食用菌中，除茯苓、猪苓、隐孔菌等少数几个菌种的培养基质可利用针叶林废弃物做培养料，其他木腐菌是不能利用针叶林木屑的，针叶林木屑中的松油脂对菌丝有毒害作用。而干巴菌的生长却有赖于针叶林木屑中的松油脂。
[0019]实施例1
—干巴菌组织分离培养基制备
培养基配方:马铃薯150g、葡萄糖10g、琼脂20g、蛋白胨5g、松树皮40g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁4g，其制备方法如下:
将马铃薯洗净去皮,按配方比例称取,切成0.4cm的片，加固液体积比I倍的水于95°C煮4min，，用双层纱布过滤得到滤液a ;按配方比例称取松树皮，加固液体积比2倍的水于95°C下熬煮4min，过滤，得到滤液b ；合并滤液a和滤液b，于95°C下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4,用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力
1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌3(T40min制备得到。
[0020]实施例2
—干巴菌组织分离培养基制备
培养基配方:马铃薯250g、葡萄糖30g、琼脂30g、蛋白胨7g、松树皮40g、松毛20g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁6g，其制备方法如下:
将马铃薯洗净去皮，按配方比例称取，切成0.6cm的片，加固液体积比3倍的水于I10C煮6min，用双层纱布过滤得到滤液a ;按配方比例称取松树皮和松毛，加固液体积比5倍的水于100°C下熬煮lOmin，过滤，得到滤液b ;合并滤液a和滤液b，于110°C下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌40min制备得到。
[0021]实施例3
—干巴菌组织分离培养基制备
培养基配方:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂25g、蛋白胨6g、松毛50g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁5g，其制备方法如下:
将马铃薯洗净去皮,按配方比例称取,切成0.5cm片，加固液体积比2倍的水于100°C煮5min，用双层纱布过滤得到滤液a ;按配方比例称取松树皮和/或松毛，加固液体积比4倍的水于98°C下熬煮8min，过滤，得到滤液b ；合并滤液a和滤液b，于100°C下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力1.5Kg/cm2、温度124°C灭菌35min制备得到。
[0022]实施例4
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:棉籽壳50g、松木屑35g、麸皮14g和石膏粉lg，其制备方法如下:
按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比2倍的水于20°C下浸泡30h，过滤，得到滤液；在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为60%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度126°C灭菌10min制备得到。
[0023]实施例5
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:棉籽壳70g、松木屑40g、麸皮15g和石膏粉1.5g,其制备方法如下:
按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比4倍的水于26°C下浸泡18h，过滤，得到滤液；在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度126°C灭菌140min制备得到。
[0024]实施例6
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:棉籽壳20g、松木屑30g、麸皮1g和石膏粉0.5g，其制备方法如下:
按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比3倍的水于23°C下浸泡24h，过滤，得到滤液；在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为63%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度126°C灭菌130min制备得到。
[0025]实施例7
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:松木屑30g、松毛20g、麸皮10g、包谷芯30g、包谷面9g和石膏粉lg，其制备方法如下:
按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比2倍的水于20°C下浸泡24h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为60%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌10min制备得到。
[0026]实施例8
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:松木屑20g、松毛10g、麸皮10g、包谷芯35g、包谷面5g和石膏粉1.5g，其制备方法如下:
按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比3倍的水于26°C下浸泡48h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度126°C灭菌140min制备得到。
[0027]实施例9
——干巴菌固体培养基制备
培养基配方:松木屑5g、松毛30g、麸皮15g、包谷芯15g、包谷面20g和石膏粉0.5g，其制备方法如下:
按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比3倍的水于25°C下浸泡30h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为62%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌120min制备得到。
[0028]实施例10
荞籽70g、松木屑25g和石膏粉1.5g，其制备方法如下:
按配方比例称取荞籽，加入固液体积比2倍的水于20°C下浸泡40h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为60%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度126°C灭菌10min制备得到。
[0029]实施例11
荞籽50g、松木屑35g和石膏粉0.5g，其制备方法如下:
按配方比例称取荞籽，加入固液体积比3倍的水于26°C下浸泡72h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌150min制备得到。
[0030]实施例12
荞籽50g、松木屑30g和石膏粉lg，其制备方法如下:
按配方比例称取荞籽，加入固液体积比2.5倍的水于2(T26°C下浸泡48h，过滤得到滤液，在滤液中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为64%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121°C灭菌120min制备得到。
[0031]实施例13
在江川县安化乡云南松林地选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样，在现场将采集到的干巴菌子实体用75%的酒精棉球作表面消毒处理，掰开子实体，用解剖刀切取
0.1cm的干巴菌子实体置入实施例2制备的培养基中，置20°C下避光培养36h后菌丝萌发，挑取尖端菌丝再接入实施例6制备的培养基中，于20°C下避光培养6天得到目标物。本实施例制备得到的菌丝洁白，层次分明，长势旺，转色好，见附图1，经鉴别，目标物为干巴菌。
[0032]实施例14
在江川县安化乡云南松林地选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样，将采集到的干巴菌子实体用75%的酒精棉球作表面消毒处理，掰开子实体，用解剖刀切取0.2cm的干巴菌子实体置入实施例1制备的培养基中，置26°c下避光培养48h后菌丝萌发，挑取尖端菌丝再接入实施例5制备的培养基中，于26°C下避光培养8天得到目标物。本实施例制备得到的菌丝洁白，层次分明，长势旺，转色好，见附图2，经鉴别，目标物为干巴菌。
[0033]实施例15
在江川县安化乡云南松林地选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样，将采集到的干巴菌子实体用75%的酒精棉球作表面消毒处理，掰开子实体，用解剖刀切取0.15cm的干巴菌子实体置入实施例1制备的培养基中，置25°C下避光培养72h后菌丝萌发，挑取尖端菌丝再接入实施例5制备的培养基中，于26°C下避光培养7天得到目标物。本实施例制备得到的菌丝洁白，层次分明，长势旺，转色好，见附图3，经鉴别，目标物为干巴菌。
【权利要求】
1.一种干巴菌菌种的分离培养方法,其特征在于包括米样、表面灭菌、分离及纯培养步骤，具体包括: A、采样:在云南松林地中选择生长Γ7天以内的干巴菌子实体进行采样并进行保藏； B、表面灭菌:将采集的干巴菌子实体进行表面灭菌处理； C、分离及纯培养:将灭菌处理后的干巴菌子实体掰开，切取0.Γ0.2cm的干巴菌子实体置入由马铃薯15(T250g、葡萄糖l(T30g、琼脂2(T30g、蛋白胨5?7g、松树皮和/或松毛4(T60g、磷酸二氢钾2?4g、硫酸镁4?6g制备得到的干巴菌组织分离培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养36?72h，再接种至由棉籽壳或荞籽(T70g、松木屑和/或松毛3(T50g、麸皮(Tl5g、包谷芯和/或包谷面(T40g、石膏粉0.5?1.5g制备得到的干巴菌固体培养基的培养基平面或试管斜面中，于2(T26°C下避光培养6?8天得到目标物，移入干巴菌固体培养基的试管斜面保存。
2.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于A步骤中所述的保藏为密封(T4°C低温保藏。
3.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于A步骤所述的保藏的时间为8?24h。
4.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于B步骤中所述的表面灭菌处理是用65?75%的酒精进行表面消毒灭菌处理。
5.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌组织分离培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂25g、蛋白胨6g、松树皮和/或松毛50g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁5g制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下: A、前处理:将马铃薯洗净去皮，按配方比例称取，切成0.Γ0.6cm片，加固液体积比f 3倍的水于95?110°C煮Γ6π?η，用双层纱布过滤得到滤液a ;按配方比例称取松树皮和/或松毛，加固液体积比2飞倍的水于95?100°C下熬煮r1min，过滤，得到滤液b ； B、配制:合并滤液a和滤液b，于95?110°C下加入配方比例的琼脂粉、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4，用玻璃棒搅拌融化，移入试管或培养皿中，于压力1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌30?40min制备得到。
6.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由棉籽壳50g、松木屑35g、麸皮14g和石膏粉Ig制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下: A、前处理:按配方比例称取棉籽壳，加入固液体积比2?4倍的水于2(T26°C下浸泡18?30h，过滤，得到滤液c; B、配制:在滤液c中加入配方比例的松木屑、麸皮和石膏粉，拌匀并调节含水量为60?65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl40min制备得到。
7.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由松木屑30g、松毛20g、麸皮10g、包谷芯30g、包谷面9g和石膏粉Ig制备得到，PH值为6.5^7.5，其制备方法如下: A、前处理:按配方比例称取包谷芯和松毛，加入固液体积比2?3倍的水于2(T26°C下浸泡24?48h，过滤得到滤液d; B、配制:在滤液d中加入配方比例的松木屑、麸皮、包谷面和石膏粉，拌匀并调节含水量为60?65%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl40min制备得到。
8.根据权利要求1所述的干巴菌菌种的分离培养方法，其特征在于C步骤中所述的干巴菌固体培养基由荞籽70g、松木屑29g和石膏粉Ig制备得到，pH值为6.5^7.5，其制备方法如下: A、前处理:按配方比例称取荞籽，加入固液体积比2?3倍的水于2(T26°C下浸泡40?72h，过滤得到滤液e; B、配制:在滤液e中加入配方比例的松木屑和石膏粉，拌匀并调节含水量为60飞5%，移入菌种瓶或塑料袋中，封口，于1.5Kg/cm2、温度121?126°C灭菌10(Tl50min制备得到。
【文档编号】C05G3/00GK104381023SQ201410739268
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】罗星野, 罗健, 陈天蓉 申请人:罗星野, 罗健, 陈天蓉