一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBET11a与应用。该蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗盐胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
【专利说明】一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBETI 1a与应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物【技术领域】，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基 因GsBETlla与应用。
【背景技术】
[0002] 目前，受全球气候变化、人口不断增长的影响，土壤盐碱化日趋严重。我国长江以 北以及沿海许多地区，土壤中盐碱含量往往过高，对植物造成危害。这种由于土壤盐碱含量 过高对植物造成的危害称为盐害，植物对盐害的适应能力叫抗盐性。根据许多研究报道，土 壤含盐量超过0. 2%?0. 25%时就会造成危害。据联合国教科文组织和粮农组织不完全统 计，我国盐碱地总面积为9913万hm2,东北松嫩平原西部有盐碱地373万hm 2,其中黑龙江省 盐碱地面积就高达1740余万亩。为确保我国粮食供给的安全，全国耕地面积必须保证在18 亿亩以上，但实际上我国的耕地面积却逐年减少，目前已逼近这一红线。因此，开发利用盐 碱地和挖掘逆境生态区的生产潜力成为了保障我国农业稳定持续高效发展的重要课题。
[0003] 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展和基因工程技术的日臻成熟，通过挖掘 耐盐碱的关键调控基因，借助转基因分子育种手段来改良作物的抗盐碱性，进而提高作物 产量也已成为可能。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种蛋白质。
[0005] 本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
[0008] 本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述BI)至B6)中的任一种：
[0009] BI)编码上述所述蛋白质的核酸分子；
[0010] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0011] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0012] B4)含有BI)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
[0013] B5)含有BI)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有 B3)所述重组载体的重组菌；
[0014] B6)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0015] 上述生物材料中，BI)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0016] 上述所述蛋白质或上述所述相关生物材料在提高植物抗逆性中的应用也属于本 发明的保护范围。
[0017] 上述应用中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
[0018] 上述蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019] 本发明还提供一种构建转基因植物的方法。
[0020] 本发明所提供的构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使上述蛋白质在出发植 物中过表达，进而使植物的抗逆性提高。
[0021] 上述方法中，所述使上述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物中导 入上述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高。
[0022] 上述方法中，所述抗逆性为抗盐胁迫。
[0023] 上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为 拟南芥。
[0024] 本发明提供了一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsBETlla与应用。通过 实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗盐胁迫的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要 应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为GsCBRLK蛋白在酵母细胞NMY51中的表达。
[0026] 图2为酵母双杂交筛选及回转验证。图2A为在10mM3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade 培养基上的复筛；图 2B 为在 2mM3-AT、10mM3-AT、40mM3-AT 的 SD/-Trp-Leu-His-Ade 培养基 上的回转验证。
[0027] 图3为采用酵母双杂交技术在酵母体内验证GsBETlla与GsCBRLK蛋白相互作用。
[0028] 图4为采用BiFc技术在植物体内验证GsBETlla与GsCBRLK蛋白相互作用。
[0029] 图5为GsBETlla蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析。
[0030] 图6为在盐胁迫条件下的野生型与转基因拟南芥种子的萌发情况、种子萌发率、 幼苗展叶率和鲜重的比较。
[0031] 图7为在盐胁迫条件下的野生型与转基因拟南芥幼苗的根长、叶绿素含量和丙二 醛含量的比较。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实验材料：野生大豆G50109种子在文献"Liang Yang, Wei Ji, Yanming Zhu, Peng Gao, Yong Li, Hua Cai,Xi Bai and Dianjing Guo. GsCBRLK, a calcium/ calmodulin-binding receptor-1 ike kinase，is a positive regulator of plant tolerance to salt and ABA stress.Journal of Experimental Botany，2010, 61 (9) :2519-33. "中公开过，公众可从东北农业大学处获得。
[0035] pA7_NYFP 和 pA7_CYFP 载体在文献 "Chen S，Tao L，Zeng L，Vega-Sanchez ME, Umemura K，Wang GLA highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol. 2006, 7(5) :417-27. "中公开过，公众可从东北农业大学获得。
[0036] pCAMBIA330035Su 载体在文献 "Hussam H. Nour-Eldin, Bjarne G. Hansen, Morten H. H. Nurhulm, Jacob K. Jensen and Barbara A. Halkier. Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments. Nucleic Acids Research, 2006, 3(18) :el22. "中公开过，公众可从东北农业大学获得。
[0037] 实施例1、野生大豆中耐盐相关蛋白编码基因GsBETlla的分离
[0038] 一、野生大豆cDNA文库的构建
[0039] 1、选取饱满的野生大豆G50109种子，用浓H2SO4处理10min，无菌水冲洗3?4次， 25°C暗培养2-3d催芽。待芽长到1?2cm时，将其转移至l/4Hogland营养液中，置于人工 气候箱中培养。
[0040] 2、取3周龄野生大豆幼苗的根（根尖3cm)和叶（未完全展开的第3个三出复叶）， 采用RNaprep pure Plant Kit (天根，货号DP441)试剂盒提取总RNA。
[0041] 3、以总 RNA 为模板，米用 EasyClone reverse transcriptase (DUAL，货号 P01011) 反转录合成第一链cDNA。
[0042] 4、采用 EasyClone Polymerase Mix (DUAL，货号 P01011)进行 LD-PCR 获得 dsDNA，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察到0. 3?6Kb的弥散状条带。采用 SfiI(Fermentas，货号 FD1824)酶切 dsDNA，通过 CHROMA SPINTM-400(Clontech，货号 636076)纯化dsDNA去除小片段。
[0043] 5、将纯化后的dsDNA与SfiI酶切后的pPR3-N(DUAL，货号P03234)载体连接，电转 化大肠杆菌感受态细胞DH10B (Invitrogen，货号12033015)，共获得约I. 2 X IO6个单克隆， 文库复杂度符合要求。
[0044] 6、随机挑选20个阳性克隆进行PCR检测，发现扩增条带大小在200_2000bp之间， 文库覆盖度较大。
[0045] 7、收集所有单克隆，提取质粒备用。
[0046] 二、耐盐碱蛋白激酶基因GsCBRLK酵母双杂交诱饵表达载体的构建
[0047] 1、设计GsCBRLK基因PCR扩增的引物，并在引物两端添加SfiI酶切位点（下划线 所示序列为酶切识别位点）。引物序列如下：
[0048] 5, -ATTAACAAGGCCATTACGGCCATGAAGAAAACACCAG-3' ；
[0049] 5' -AACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCAGCAGATACAAATT-3 '。
[0050] 2、以pET32b-GsCBRLK质粒为模板，采用上述步骤1中的引物PCR扩增GsCBRLK基 因全长⑶S区，用SfiI酶切PCR回收产物和PBT3-STE空载体，并回收酶切产物。
[0051] 3、将酶切回收后的GsCBRLK基因与pBT3-STE载体连接，构建pBT3-STE-GsCBRLK 诱饵表达载体，使GsCBRLK蛋白与LexA-VP 16-Cub融合表达。
[0052] 三、GsCBRLK蛋白表达及拓扑结构分析
[0053] 为了检测GsCBRLK诱饵蛋白是否表达，采用LiAc法制备酵母NMY51感受态细 胞，通过LiAc/PEG法将pBT3-STE-GsCBRLK诱饵表达载体转化酵母感受态细胞，再用液体 SD/-Leu培养基活化重组酵母菌，采用TCA法提取酵母总蛋白，进行Western blot检测。结 果显示在含pBT3-STE-GsCBRLK质粒的酵母总蛋白中能够检测到目的条带，说明GsCBRLK蛋 白在酵母细胞NMY51中能够正常表达（图1)。
[0054] 为了统计重组酵母菌在不同选择培养基上的生长情况，将pBT3-STE-GsCBRLK/ pOst卜NubI、 pBT3-STE-GsCBRLK/pPR3-N、 pTSU2-APP/pNubG-Fe65、 pTSU2-APP/ pPR3-N共转化酵母NMY51感受态细胞，并涂板至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、 SD/-Trp-Leu-Hi s-Ade 筛选培养基，30°C 倒置培养 3-7d 后发现：含 pBT3-STE-GsCBRLK/ pOstl-Nubl的重组酵母菌在SD/-Trp-Leu_His和SD/-Trp-Leu-His_Ade缺陷培养基上均 能正常生长，说明GsCBRLK蛋白拓扑结构符合该酵母双杂交系统；含pBT3-STE-GsCBRLK/ PPR3-N的酵母菌在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，但在SD/-Trp-Leu-His和 SD/-Trp-Leu-Hi S-Ade培养基上则不生长（表1)。因此，在进行大规模酵母双杂交筛选时， 我们采用SD/-Trp-Leu-His作为筛选培养基。
[0055] 表1、GsCBRLK蛋白拓扑结构分析
[0056]
【权利要求】
1. 蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种： B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体； B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒； B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所 述重组载体的重组菌； B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列 如序列表中序列1所示。
4. 权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述相关生物材料在提高植物抗逆性中的 应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗盐胁迫。
6. 权利要求1所述蛋白质在与GsCBRLK蛋白相互作用中的应用。
7. -种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使权利要求1所述蛋白质在出发植物 中过表达，进而使植物的抗逆性提高。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述使权利要求1所述蛋白质在出发植物 中过表达的方法为：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植 物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高； 所述蛋白质的编码基因序列如序列表中序列1所示。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗盐胁迫。
10. 根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或 双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
【文档编号】A01H5/00GK104356214SQ201410604973
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】孙晓丽, 秦智伟, 朱延明, 杨克军, 孙明哲 申请人:黑龙江八一农垦大学, 东北农业大学