一种菹草的组织培养方法
【专利摘要】一种菹草的组织培养方法，该方法步骤为，从沉水植物菹草上剪取带节茎段，在自来水中浸泡后剪去叶片，用去离子水冲洗；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成1cm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；将玻璃瓶置于无菌培养室，条件：温度为25±1℃，光暗比12h：12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件：25±1℃，光暗比12h：12h，培养成为长势健康的幼苗。本发明的有意效果为，本发明摸索的的菹草培养方法十分适宜，可以克服现有技术的缺陷，提高了组培的成活率。
【专利说明】一种菹草的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种菹草的组织培养方法【技术领域】。
【背景技术】
[0002]与陆生植物相比，水生植物极易污染，菹草作为一种水生植物，其离体培养过程中外植体表面灭菌和尔后内生菌抑制的难度都较其它植物高，实验每一环节都有可能出现污染。灭菌剂的种类选择、浓度配比以及操作程序的设定都是灭菌成败的关键。灭菌强度过大、时间过长,植物会全部死亡；灭菌不足,会全部污染。这两大技术难点往往成为水生植物组织培养的瓶颈。
[0003]虽然近年来已有一些针对菹草组培方法的研究，但是该植物特异性较强，培养条件难以统一。
【发明内容】
[0004]本发明通过多种实验设计，本实验获得了一套适宜的培养方法。本发明采用如下技术方案实现。
[0005]一种菹草的组织培养方法，该方法步骤为，从沉水植物菹草上剪取带节茎段，在自来水中浸泡后剪去叶片，用去离子水冲洗；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成Icm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；将玻璃瓶置于无菌培养室，条件:温度为25土 1°C，光暗比ia:12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件:25±1°C，光暗比12h:12h，培养成为长势健康的幼苗。
[0006]本发明方法具体的步骤为，从沉水植物菹草上剪取嫩尖部分的带节茎段，长约10cm，在自来水中浸泡1小时，剪去叶片，用去离子水冲洗3遍；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成Icm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；置于无菌培养室，条件:25±1°C，光暗比12h:12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件:25土 1°C，光暗比12h:12h，培养成为长势健康的幼苗。
[0007]本发明MIII液体培养基的配制方法步骤为:以总体积IL计:
[0008]1)大量元素称量并根据顺序先后溶解于一定量的纯水中，大量元素包括:0.0848gNa2Si03.5H20，0.0425g NaNO3,0.0068g KH2PO4,0.086g CaSO4.2H20，0.00745g KCl，0.0735gCaCl2.2H20，0.0615g MgSO4.7H20 ；
[0009]2)加入少许IN的盐酸溶液，搅拌使物质溶解(可用微波加热或超声波处理助溶)；
[0010]3)加入Iml的100倍微量元素母液；微量元素母液的配方为:取30.8gH3BO4, 12.08gMnS04.4H20, 2.209g ZnSO4.7H20, 0.968g Na2Mo04.2H20, Ig CuSO4.5H20,3.792gAlK (SO4)2.12H20,0.952g CoCl2.6H20,1.124g NiSO4.7H20,0.952g KBr, 0.664g KI，0.774gH2Se03，溶解于水，定容至100ml;
[0011]4)加入IOml Fe-EDTA溶液(需预先配制FeCl3贮备液:将2.7g FeCl3.6H20和IOml0.1N HCl溶解于蒸馏水中，最终定容至100ml，得到FeCl3贮备液；然后配制Fe-EDTA溶液:将0.372gNa2EDTA.2H20溶于大约400ml蒸馏水中，加入5ml上述FeCl3贮备液，用高压灭菌锅灭菌，取出冷却至室温后在无菌条件下用无菌蒸馏水定容至500ml)；
[0012]5)定容至1L，调整pH为6.0 ;
[0013]6)高温高压灭菌，取出冷却至室温后使用，或直接置于冰箱冷藏，每次使用前要恢
复至室温。
[0014]本发明MIII固体培养基的配方为:以总体积IL计:完成MIII液体培养基配制的I~4步骤后,加入6g琼脂，20g鹿糖；加热,煮沸后加入植物激素Img6-BA、0.1mg NAA,定容至1L，调整pH为6.0 ;高温高压灭菌，取出凝固后使用，或直接置于冰箱冷藏。
[0015]本发明在超净工作台内灭菌的方法为，首先使用浓度为0.01%升汞灭菌4min，间歇IOmin,再使用浓度为0.01%升萊灭菌4min。
[0016]本发明的有意效果为，本发明摸索的的菹草培养方法十分适宜，可以克服现有技术的缺陷，避免了高杀伤性(NaClO和酒精)和过高浓度的灭菌剂，减少了植物的死亡率，同时采用间歇法，以温和的方式延长灭菌作用时间，减少污染率的同时也提高了植物成活率。
【具体实施方式】
[0017]下面就【具体实施方式】对本发明做进一步解释。
[0018]首先， 申请人:做了一些菹草组织培养的预备试验。如下。
[0019]1、不同灭菌剂对菹草组织培养的影响
[0020]表1中显示了使用不同浓度的升汞、NaClO和酒精对菹草外植体进行表面灭菌的结果。可以看到，水生植物菹草的外植体对这三种表面灭菌剂都十分敏感。不论是升汞、NaCIO，还是酒精，灭菌效果都呈现出相同的规律，即灭菌剂浓度越高，后续实验出现的污染率越低，但外植体被灭死的概率则越高；反之，灭菌剂浓度越低，灭死率越低，但污染率却越高。其中，菹草对酒精的敏感性最高，且常用于植物组织培养的酒精浓度(70%)对菹草来说也是致命的；菹草对NaClO的敏感性也比较高，而且用NaClO灭菌是高灭死率与高污染率同时存在，外植体难以在其作用下保证生命活力；相对而言，菹草对升汞的敏感性就不如前两者。可以从0%灭死率的0.01%浓度处理组以及0%污染率的0.075%和0.1%浓度处理组中获得进一步解决灭菌问题的突破口。
[0021]表1菹草对不同灭菌剂的敏感程度
【权利要求】
1.一种菹草的组织培养方法，其特征在于，该方法步骤为，从沉水植物菹草上剪取带节茎段，在自来水中浸泡后剪去叶片，用去离子水冲洗；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成Icm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；将玻璃瓶置于无菌培养室，条件:温度为25土1°C，光暗比12h:12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件:25±1°C，光暗比12h:12h，培养成为长势健康的幼苗。
2.根据权利要求1所述的一种菹草的组织培养方法，其特征在于，该方法具体的步骤为，从沉水植物菹草上剪取嫩尖部分的带节茎段，长约10cm，在自来水中浸泡I小时，剪去叶片，用去离子水冲洗3遍；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成Icm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；置于无菌培养室，条件:25±1°C，光暗比12h:12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件:25±1°C，光暗比12h:12h，培养成为长势健康的幼苗。
3.根据权利要求1或2所述的一种菹草的组织培养方法，其特征在于，MIII液体培养基的配制方法步骤为:以总体积IL计: 1)大量元素称量并根据顺序先后溶解于一定量的纯水中，大量元素包括:0.0848gNa2Si03.5H20，0.0425g NaNO3,0.0068g KH2PO4,0.086g CaSO4.2H20，0.00745g KCl，0.0735gCaCl2.2H20，0.0615g MgSO4.7H20 ； 2)加入少许IN的盐酸溶液，搅拌使物质溶解(可用微波加热或超声波处理助溶)； 3)加入Iml的100倍微量元素母液；微量元素母液的配方为:取30.8g H3BO4,12.08gMnS04.4H20, 2.209g ZnSO4.7H20, 0.968g Na2Mo04.2H20, Ig CuSO4.5H20,3.792gAlK (SO4)2.12H20,0.952g CoCl2.6H20,1.124g NiSO4.7H20,0.952g KBr, 0.664g KI，0.774gH2Se03，溶解于水，定容至100ml;`` 4)加入IOmlFe-EDTA溶液(需预先配制FeCl3贮备液:将2.7g FeCl3.6H20和IOml0.1NHCl溶解于蒸馏水中，最终定容至100ml，得到FeCl3贮备液；然后配制Fe-EDTA溶液:将0.372gNa2EDTA.2H20溶于大约400ml蒸馏水中，加入5ml上述FeCl3贮备液，用高压灭菌锅灭菌，取出冷却至室温后在无菌条件下用无菌蒸馏水定容至500ml)； 5)定容至1L，调整pH为6.0; 6)高温高压灭菌，取出冷却至室温后使用，或直接置于冰箱冷藏，每次使用前要恢复至室温。
4.根据权利要求1或2所述的一种菹草的组织培养方法，其特征在于，MIII固体培养基的配方为:以总体积IL计:完成MIII液体培养基配制的I~4步骤后，加入6g琼脂，20g蔗糖；加热，煮沸后加入植物激素Img6-BA、0.1mg NAA，定容至1L，调整pH为6.0 ;高温高压灭菌，取出凝固后使用，或直接置于冰箱冷藏。
5.根据权利要求1或2所述的一种菹草的组织培养方法，其特征在于，在超净工作台内灭菌的方法为，首先使用浓度为0.01%升汞灭菌4min，间歇lOmin，再使用浓度为0.01%升萊灭菌4min。
【文档编号】A01H4/00GK103734017SQ201410029624
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】徐润冰, 常学秀, 王小龙, 王龙昌, 刘磊, 桂秘, 鲍志豪 申请人:云南大学