Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。本发明首先将酶切线性化后的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备得到Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。该方法在国内外率先建立了一种新型可诱导型非免疫耐受的乙肝疾病模型，即Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠，可针对性的应用于乙肝相关研究领域中，能够真实、全面地反映临床乙肝发生、发展过程，填补了国内外此类动物模型的空白。
【专利说明】Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物模型构建领域。更具体地，涉及一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是全球范围内影响人类健康的重大问题。由HBV感染导致的慢性进行性肝脏炎症病变，常常发展为肝硬化、肝癌并最终导致死亡。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年因此死亡的人数约为100万~200万。我国一直是HBV感染的高发区，最新的资料表明，我国现有的慢性HBV感染者约为9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，占慢性HBV感染者的1/5强。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于携带有大量HBV，是HBV的最主要传染源。我国每年都投入大量的经费和人力物质资源用于该类人群的治疗和阻止HBV在人群中的进一步传播，给我国带来了非常严重的经济和社会负担，使本已十分有限的医疗资源更加紧张。为此，开展深入和多层次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相关研究，对于攻克这一影响我国近I亿人口身体健康的疾病，维护我国人口的身体健康具有重要意义。
[0003]在乙型肝炎的相关研究中，乙型肝炎动物模型具有举足轻重的地位，乙型肝炎动物模型应用于从HBV感染机制、被感染机体的免疫状态改变、HBV在被感染机体内的免疫逃逸机制、HBV的基因治疗以及HBV治疗药物的疗效评价等的各个层次和各个方面。因而合适的动物模型的建立与选 择往往成为HBV研究工作的关键，对研究工作起到事半功倍的作用。为此，许多学者都曾致力于建立各种类型的乙型肝炎动物模型。然而由于人类HBV属于嗜肝DNA病毒科，有较强的种属特异性，自然条件下只感染人和非人灵长类(如黑猩猩等)，所以建立起能广泛应用的动物模型并非易事。黑猩猩模型因其体积较大、成本高以及受伦理道德约束等限制了其应用；而树駒模型则由于其感染效率低，仅能导致短暂的轻度感染，病毒滴度很低，而难以推广应用；鸭乙型肝炎的动物模型，则存在其药代动力学和免疫学遗传背景与人类有很大的不同的缺陷、土拨鼠仅产于北美，运输困难且价格昂贵，从而限制了这些动物模型的广泛应用，进而限制了对乙型肝炎发病机制、免疫病理、治疗药物以及免疫治疗的相关研究。
[0004]近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研究人员建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型、基因转染HBV小鼠模型和HBV转基因小鼠模型。
[0005]但是，尽管人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型可以说是目前最好的HBV感染复制模型，但是由于该模型没有免疫机能，因而不能进行免疫介导的病毒清除和肝炎免疫致病机制的研究。基因转染HBV小鼠模型由于是一过性的HBV复制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不适用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射剂量太大(相当于小鼠全身体液的总量)，对小鼠肝脏和其他器官造成的损伤也不能忽视。目前已有的HBV转基因小鼠也存在着明显的缺陷。首先，目前已有的HBV转基因小鼠由于并非通过被HBV感染的途径建立，因此无法用来进行HBV进入被感染机体和HBV在机体内的散布研究；其次，目前已有的HBV转基因小鼠对HBV病毒抗原处于免疫耐受状态，机体不能产生对HBV的免疫反应，也不产生乙型肝炎病变。以上原因导致了可用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的动物模型的缺失，客观上影响了相关研究的深入开展。因此建立可控、支持HBV体内感染并能导致类似于临床乙肝病变的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成为深入了解乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制，抗乙肝药物的研发及评价新的乙肝免疫疗法的重要关键因素。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是为了克服现有制备乙肝研究用动物模型存在的缺陷，提供一种新型可诱导型的、非免疫耐受的乙肝疾病动物模型的构建方法。
[0007]本发明的目的是提供OVA-HBsAg基因在构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠方面的应用。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。
[0009]本发明上述目的通过以下技术方案予以实现:
本发明提供了 OVA-HBsAg基因在构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠方面的应用。
[0010]所述的OVA为卵清蛋白(ovalbumin，OVA)基因。
[0011]本发明还提供了一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法，具体包括以下步骤:
51.携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton进行酶切线性化；
52.将酶切线性化后的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2_Anton，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备得到Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。
[0012]其中，步骤 SI所述的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠；表达载体pCCALL2-Anton的全长序列如SEQ ID NO:1所示。表达载体pCCALL2-Anton的结构示意图如附图1所示,表达载体pCCALL2_Anton的质粒图谱如附图2所示。
[0013]步骤SI所述酶切的反应体系酶切反应体系如下:
【权利要求】
1.0VA-HBsAg基因在构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠方面的应用。
2.—种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: S1.携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton进行酶切线性化； S2.将酶切线性化后的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2_Anton，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备得到Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤SI所述酶切的步骤如下: S11.利用内切酶如3/，371:，酶切311; S12.酶切后电泳鉴定； S13.酶切产物纯化回收； S14.回收产物浓度调至5ng/uL，_20°C保存，用于后续显微注射。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S2所述显微注射法的具体步骤如下: 521.选6~8周龄发育良好的C57BL/6JXDBA母鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素，48h后注射人绒毛膜促性腺激素； 522.所述C57BL/6JXDBA母鼠经过步骤S21的激素超排处理后，与C57BL/6J公鼠按1:1合笼，次日清晨挑选阴栓阳性母鼠，从阴栓阳性母鼠得到单细胞受精卵； 523.将结扎KM公鼠与正常KM母鼠按1:2合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕KM母鼠； 524.将酶切回收后的线性化pCCALL2-Anton的溶液利用原核显微注射方法直接注入单细胞受精卵的雄性原核内； 525.取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待KM母鼠产仔，经PCR鉴定阳性的小鼠即为Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。
5.一种按照权利要求2所述构建方法构建的Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠在应用于研究之前，需要用Cre重组酶诱导目的基因OVA-HBsAg表达。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述诱导的方法为:将Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因母鼠与Cre阳性公鼠进行杂交。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述杂交的方法为将Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因母鼠与Cre阳性公鼠按照2:1的数量比例合笼随机交配，获得子代小鼠。
【文档编号】A01K67/027GK103952442SQ201410013417
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】李秀梅, 刘光泽, 佟明华, 易学瑞, 孔祥平 申请人:中国人民解放军第四五八医院