一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法
【专利摘要】一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法，属于植物生物【技术领域】，以春兰为母本，大花蕙兰为父本，通过人工授粉获得杂交种，在杂交种的蒴果未开裂前采收，经表面消毒和种子用营养液前处理后进行无菌播种，经暗培养种子萌发、种子直接成苗或原球茎增殖，原球茎再经芽诱导、根诱导、组培苗炼苗，然后进行温室栽培。本发明为一种杂交成苗快、品质好、高效、简便、推广性强的春兰和大花蕙兰杂交和无菌播种育苗方法。
【专利说明】一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一种远缘杂交育种和杂交种繁殖方法。【背景技术】
[0002]春兰(Cym.goeringii)，又称草兰、山兰、朵朵香。是兰科，兰属，地生兰类多年生草本。是中国兰的代表种，原产于我国长江流域或西南地区，日本和朝鲜半岛也有分布。春兰名优品种具有很高的观赏价值和经济价值，在东南亚特别是日本、韩国和台湾地区，春兰十分受欢迎。春兰传统的品种选育以绿色为基本，崇尚瓣型和素心，是贯彻执行瓣型理论最具代表的国兰种，因此流传至今的名优春兰品种，绝大部分为绿色瓣型花或素心花品种。
[0003]大花繁竺XCymbidium又叫喜姆比兰和蝶兰。兰科、兰属植物。它是由兰属中的大花附生种、小花垂生种以及一些地生兰经过一百多年的多代人工杂交育成的品种群。大花蕙兰叶长碧绿，花姿粗旷，花色艳丽，是世界著名的“兰花新星”。在国际花卉市场十分畅销，深受花卉爱好者的倾爱。大花蕙兰的生产地主要是日本，韩国和中国，澳洲及美国等。
[0004]鉴于人们对新产品和新兰花的追求，培育更多品种的兰花种是植物界的研究的一个课题。
【发明内容】
[0005]本发明目的是为人们提供一种以春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法。
[0006]本发明以春兰为母本，大花蕙兰为父本，母本在开花2天后去雄，父本取开花后3~5天的花粉，通过人工授粉获得杂交种，在杂交种的蒴果未开裂前采收，经表面消毒和种子用营养液前处理后进行无菌播种，经暗培养种子萌发、种子直接成苗或原球茎增殖，原球茎再经芽诱导、根诱导、组培苗炼苗，然后进行温室栽培。
[0007]本发明针对春兰与大花蕙兰种间杂交育种和种子无菌播种中，如何提高优良品种授粉结实率，种子萌发率、原球茎增殖率、诱芽诱根成苗率和炼苗成活率等，提出一种使杂交成苗快，品质好，高效、简便、推广性强的春兰和大花蕙兰杂交和无菌播种育苗方法。
[0008]具体方法:
无菌播种是:将未开裂的蒴果表面用质量分数为75%的酒精消毒后，以质量分数为
.0.1%的HgCl水溶液浸泡10分钟后取出，再浸入质量分数为95%的酒精内，取出蒴果立即在酒精灯上点燃，待蒴果表面酒精燃烧完后，切开蒴果，取出种子，放入装有营养液的玻璃试剂瓶内，振荡10~20分钟后，将种子用无菌不锈钢小勺均匀分散于培养基表面。
[0009]种子前处理营养液中含有I/2MS、萘乙酸(NAA) 0.5mg/1、蔗糖20g/1和蛋白胨
.0.5g/l，营养液的pH值为5.25~5.3 ;所述无菌播种培养基中含有1/2MS、萘乙酸(NAA)
.0.5mg/l、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，培养基的pH值为5.25~
5.3。
[0010]暗培养种子萌发是:将连同培养基的种子置于无光、培养温度为23±0.2°C的环境温度下放置。
[0011]原球茎增殖是:待原球茎萌发至长度为2~5mm时，原球茎材料每隔60天转入一次增殖培养基，转入增殖培养基后将玻璃瓶置于温度为23±0.2°C的环境中，并且光照8小时/天，光照强度为15001ux±100 lux ;所述增殖培养基中含有1/2MS、2，4_D2mg/l、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，所述增殖培养基的pH值为5.25~5.3。
[0012]种子直接成苗是:待原球茎萌发的幼芽长度为2~5mm时，向玻璃瓶内转入二次培养基；所述二次培养基中含1/2MS、萘乙酸(NAA) 0.5mg/l、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，二次培养基的pH值为5.25~5.3。
[0013]茎诱芽是:待原球茎萌发的幼芽长度为I~2cm时，转入诱芽培养基，置于23±0.2°C的环境中2~3个月，期间光照12小时/天，光照强度为20001ux±100 lux ;所述诱芽培养基中含1/21^、萘乙酸(應么)0.lmg/l、6-BAlmg/l、蔗糖20g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，所述诱芽培养基的pH值为5.25~5.3。
[0014]根诱导是:待原球茎萌发的幼芽长度为2~3cm时，向玻璃瓶内转入生根壮苗培养，置于23±0.2°C的环境中，并且光照10小时/天，光照强度15001ux±100 lux ;所述生根壮苗培养基中含1/21^、萘乙酸(應么)0.5mg/l、6-BA0.5mg/l、蔗糖20g/l、蛋白胨0.5g/1、活性碳0.5g/l和琼脂6g/l，所述生根壮苗培养基的pH值为5.25~5.3。
[0015]组培苗移栽炼苗是:在小苗生长至8~10 cm、形成3~4个叶片、根长5~8cm、根数2~3条时出瓶移栽至移栽基质，移栽后浇透水，置于光照10小时/天、光照强度20001ux±100 lux、温度为20~25°C、湿度为80~85%的环境中；所述移栽基质由小号松鳞和珍珠岩以质量比为8:2的比例混合。
[0016]温室栽培的温度 条件为18~30°C，湿度为75~85%，自然光照，每3~5天浇一次透水，温室保持良好通透性，喷施广谱性杀菌剂杀虫剂，每一星期喷施I次1/2MS培养液或浓度为I %。的兰菌王。
[0017]本发明所具有的优点:
1、本发明提出当花期不遇时，短期保存花粉采用冷藏花蕊柱的方法，利用植物营养体短期保鲜的方法，使花粉最大程度的保持活力和洁净度，提高杂交成功率和种子育性。根据花蕊柱萎缩的程度，在花蕊柱腐败前取出花粉继续保存，可延长花粉的活性，提高杂交成功率。
[0018]2、本发明对播种前无菌种子进行振荡前处理，使种子充分与营养液接触，尽量克服其种皮不易透水性，使种子胚能尽早接触到营养液，加快其萌发速度。取分散于营养液的种子倒入培养基，种子连同营养液能均匀的分布于培养基表面，整个操作方便高效，污染几率极低。
[0019]3、本发明利用不同配方培养基，可采用播种培养基直接对原球茎诱芽诱根，快速成苗，再利用根茎周围少量原球茎继代增殖实现株系的快繁。原球茎也可直接继代增殖，扩大株系群体，再进行诱芽诱根壮苗培养。使多种育种途径可自由转换，更好的达到育种者的目标。
[0020]4、本发明的炼苗间采用精确控制温度、湿度和光照，大大提高小苗成活率和质量的同时，节省了经济成本。
[0021]5、本发明栽培小苗的基质为小号松鳞加珍珠岩，是酥松透气的软质料，保水性能好，对组培苗根系生长十分适合，材料收集容易，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为宜春仙春兰的开花照片。
[0023]图2为大花蕙兰的开花照片。
[0024]图3为杂交蒴果照片。
[0025]图4为种子无菌播种照片。
[0026]图5为原球茎萌发照片。
[0027]图6为直接成苗照片。
[0028]图7为原球茎增殖照片。
[0029]图8为原球茎诱芽照片。
[0030]图9为原球茎诱根照片。
[0031]图10为组培苗照片。
[0032]图11为小苗出瓶照片。
[0033]图12为炼苗室炼苗照片。
[0034]图13为温室栽培照片。
【具体实施方式】
[0035]本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但本发明的内容不是仅限于此。
[0036]本例采用春兰宜春仙为母本，大花蕙兰为父本，进行杂交无菌播种育苗，具体步骤:
1、人工授粉:在I月下旬，两亲本同时开花时，春兰宜春仙(附图1)开花两天后，去除鼻头和花粉块，在鼻头下蕊柱腔授入红花大花蕙兰品种(附图2)开花3天后的花粉块，授粉后用白色小纱袋，以免昆虫重复授粉，操作要轻柔，尽量不要碰伤蕊柱和折断花葶，保证杂交成功率，在母本花盆上注明杂交日期和杂交父本。小纱袋可在种子受精膨大后去除。
[0037]若春兰宜春仙与大花蕙兰花期不遇，可取大花蕙兰花蕊柱或花粉块放入洁净玻璃小瓶，7天内短期保存置于4°C低温冰箱备用，长期保存可放入_20°C超低温冰箱保存。
[0038]所选春兰名优品种是指香味纯正的瓣型品种、素心品种或叶艺品种，大花蕙兰优良品种指花型硕大、花色纯正，鲜艳，株型挺拔的各色品种。
[0039]2、无菌播种:9月中旬，折下蒴果(附图3 )，剥去残余花瓣，用75%酒精插净表皮后，带入无菌培养室。在超净工作台上，把种子放入0.1%的HgCl，轻轻摇晃，表面灭菌10分钟，取出蒴果晾干后，放入95%酒精浸一下，酒精灯上接触，使表面酒精燃烧完。用无菌解剖刀划开种皮，把种子刮入，已整体灭菌的装有25毫升营养液的50毫升磨口玻璃瓶，盖上瓶盖，用力振荡10分钟，用灭菌的容量为1.5毫升小勺舀出小瓶中均匀分散种子的营养液，倒入培养基，轻晃培养基，使种子均匀分布于培养基表面(附图4)。营养液为1/2MS+NAA0.5mg/1+蔗糖 20g/l+蛋白胨 0.5g/l，pH5.25-5.3。播种用培养基为 1/2MS+NAA0.5mg/l+蔗糖 20g/1+ 蛋白胨 0.5g/l+ 活性碳 0.5g/l + 琼脂 6g/l，ρΗ5.25-5.3。
[0040]3、种子萌发:种子播种后避光暗培养，培养温度23°C左右。播后43天种子开始萌发(附图5)，90天左右原球茎生长至2-5_时，需要增殖的株系转入增殖培养基。如需要种子直接成苗，原球茎生长至2-5_，可转入新的播种培养基，培养6个月后原球茎可直接分化出芽和根，直接成苗(附图6)。但这种培养方式，得到的种苗有限，但一般小苗根茎处会有部分原球茎，也可再进增殖培养。具体培养方案，可根据育种者育种思路自主选择。直接成苗培养基为1/2MS+NAA0.5mg/l+蔗糖20g/l+活性碳0.5g/l+蛋白胨0.5g/l +琼脂6g/l，ρΗ5.25~5.3ο
[0041]4、原球茎增殖:原球茎生长至0.5-lcm时，部分原球茎转入增殖培养基进行继代培养(附图7)，培养基配方为1/2MS+2, 4-D2mg/l+蔗糖20g/l +蛋白胨0.5g/l +琼脂6g/1，ρΗ5.25~5.3ο
[0042]5、原球茎诱芽:至原球茎生长至l-2cm，转入诱芽培养基，室温23度，光照强度20001ux左右，光照12小时/天，培养2个月小芽生长至2-3cm (附图8)。诱芽培养基1/2MS+NAA0.lmg/l+6-BAlmg/l + 蔗糖 20g/l+ 蛋白胨 0.5g/l + 琼脂 6g/l，ρΗ5.25-5?
[0043]6、生根壮苗培养:待芽高l_2cm时转至生根壮苗培养(附图9)，室温23度左右，光照强度15001ux左右，光照10小时/天。生根壮苗培养基:1/2MS+NAA0.5mg/l+6-BA0.5mg/I + 蔗糖 20g/l+蛋白胨 0.5g/l + 活性碳 0.5g/l + 琼脂 6g/l，pH5.25-5.3。
[0044]7、组培苗移栽炼苗。培养2个月，小苗(附图10)生长至8-10 cm，叶片3-4片，根长5-8 cm,每苗根数2-3条时移栽,移栽基质为小号松鳞:珍珠岩=8:2。口径15 cm小号盆，每盆移栽小苗(附图11) 6苗左右，栽完后就浇透水。出瓶后移栽，气候不适宜可先移入炼苗室(附图12)，温度为20-25°C，湿度80%-85%，光照强度20001ux左右，光照10小时/天。
[0045]8、温室栽培。气候适宜时小苗便可移入温室栽培(附图13)，栽培适宜温度为16-300C ,不低于5°C，不高于35°C，湿度80%左右，自然光照。3_5天浇一次透水，保持基质湿润。温室保持良好通透性，`喷施广谱性杀菌剂杀虫剂，防治病害和飞虱、草蚊、蓟马等虫害，每星期喷施I次1/2MS培养液，或浓度为1%。的兰菌王水溶液。
【权利要求】
1.一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法，其特征在于以春兰为母本，大花蕙兰为父本，母本在开花2天后去雄，父本取开花后3~5天的花粉，通过人工授粉获得杂交种，在杂交种的蒴果未开裂前采收，经表面消毒和种子用营养液前处理后进行无菌播种，经暗培养种子萌发、种子直接成苗或原球茎增殖，原球茎再经芽诱导、根诱导、组培苗炼苗，然后进行温室栽培。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述无菌播种是:将未开裂的蒴果表面用质量分数为75%的酒精消毒后，以质量分数为0.1%的HgCl水溶液浸泡10分钟后取出，再浸入质量分数为95%的酒精内，取出蒴果立即在酒精灯上点燃，待蒴果表面酒精燃烧完后，切开蒴果，取出种子，放入装有营养液的玻璃试剂瓶内，振荡10~20分钟后，将种子用无菌不锈钢小勺均匀分散于培养基表面。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于所述营养液中含有1/2MS、萘乙酸0.5mg/l、蔗糖20g/l和蛋白胨0.5g/l，营养液的pH值为5.25~5.3 ;播种用培养基中含有1/2MS、萘乙酸0.5mg/l、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，培养基的pH值为5.25 ~5.3。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述暗培养种子萌发是:将连同培养基的种子置于无光、培养温度为23 ±0.2°C的环境温度下放置。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述原球茎增殖是:待原球茎萌发至长度为2~5_时，原球茎材料每隔60天转入一次增殖培养基，转入增殖培养基后将玻璃瓶置于温度为23±0.2°C的环境中，并且光照8小时/天，光照强度为15001ux±100 lux ;所述增殖培养基中含有1/2MS、2，4-D2mg/1、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，所述增殖培养基的PH值为5.25~5.3。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述种子直接成苗是:待原球茎萌发的幼芽长度为2~5mm时，转入二次培养基；所述二次培养基中含1/2MS、萘乙酸0.5mg/l、蔗糖20g/l、活性碳0.5g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，二次培养基的pH值为5.25~5.3。`
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述茎诱芽是:待原球茎萌发的幼芽长度为I~2cm时，向玻璃瓶内转入诱芽培养基,置于23±0.2°C的环境中2~3个月，期间光照12小时/天，光照强度为20001ux±100 lux ;所述诱芽培养基中含1/2MS、萘乙酸0.lmg/1、6-BAlmg/l、蔗糖20g/l、蛋白胨0.5g/l和琼脂6g/l，所述诱芽培养基的pH值为5.25~5.3ο
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述根诱导是:待原球茎萌发的幼芽长度为2~3cm时，转入生根壮苗培养基，置于23±0.2°C的环境中，并且光照10小时/天，光照强度15001ux±100 lux ;所述生根壮苗培养基中含1/2MS、萘乙酸0.5mg/l、6-BA0.5mg/l、蔗糖20g/l、蛋白胨0.5g/l、活性碳0.5g/l和琼脂6g/l，所述生根壮苗培养基的pH值为5.25 ~5.3。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述组培苗移栽炼苗是:在小苗生长至8~10 cm、形成3~4个叶片、根长5~8 cm、根数2~3条时出瓶移栽至移栽基质，移栽后浇透水，置于光照10小时/天、光照强度20001ux±100 lux、温度为20~25°C、湿度为80~85%的环境中；所述移栽基质由小号松鳞和珍珠岩以质量比为8:2的比例混合。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述温室栽培的温度条件为18~30°C，湿度为75~85%，自然光照，每3~5天浇一次透水，温室保持良好通透性，喷施广谱性杀菌剂杀虫剂， 每一星期喷施I次1/2MS培养液或浓度为1%。的兰菌王。
【文档编号】A01H1/02GK103704130SQ201410002480
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】孙叶, 包建忠, 刘春贵, 李风童, 马辉, 陶凡, 张甜, 张靓, 陈秀兰 申请人:江苏里下河地区农业科学研究所