一种小麦cbl-cipk类抗逆调节因子及其编码基因与应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子及其编码基因与应用。本发明根据小麦盐、旱胁迫的表达谱芯片信息，选择在根和叶中表达明显受盐和旱诱导的蛋白激酶基因，并克隆了其含全长编码区的cDNA序列，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。分析表明，该基因编码CBL-CIPK类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，定名为TaCIPK33。通过转基因功能分析表明，该基因具有提高植物耐盐性和抗旱性的功能。这为深入理解小麦响应干旱、盐胁迫的分子机理提供了基础，同时该基因可应用于小麦等作物抗逆新种质的遗传改良。
【专利说明】—种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子及其编码基因与应用，属于分子生物学技术和基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]小麦是大约35%世界人口的主要食粮。干旱、盐溃化等逆境是限制小麦产量与品质的重要环境因素，且易导致感染病虫害，造成较大的经济损失。但是小麦无法逃避逆境环境，因此，克隆抗旱、耐盐基因，研究其抗旱、耐盐的分子机制，培育抗旱耐盐新品种具有重大的理论与实践意义。
[0003]丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶参与植物对不同逆境的应答反应，在提高植物抗逆性方面可发挥作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶具有“中央处理器(CPU)”的功能，接收从受体传递过来的诸如植物激素或其他外界因素等输入信息，转化成适当的输出信息，如代谢、基因表达、细胞生长和分裂等方面的变化。
[0004]根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域的相似性，将其分为:钙依赖蛋白激酶(CDPK)亚家族、SNFl相关蛋白激酶(SnRK)亚家族、类受体激酶(RLKs)亚家族、MAPK/MAPKK/MAPKKK亚家族、细胞周期蛋白依赖激酶(⑶K)亚家族、GSK3/SHAGGY亚家族等。各种逆境胁迫作用于植物细胞，首先引发细胞内Ca2+浓度的改变。钙信号通过细胞内各种钙离子感受器感知和传递钙信号，植物中有两类Ca2+依赖型感受器，一类为钙调素(CaM)，另一类为植物特有的钙调磷酸酶B类似蛋白(CBL)。CBL感受器与蛋白激酶CIPK (CBL-1nteractingProtein Kinases)相互作用形成Ca2+-CBL-CIPK复合体,CBL-CIPK复合体被激活，处于激活状态的CBL-CIPK复合体磷酸化修饰下游目的靶蛋白，解码各种动态变化的钙信号，调控相关的生理过程。CIPK被认为属`于植物SNFl相关蛋白激酶家族三大亚族之一 SnRK3亚族。
[0005]目前发现，拟南芥中存在26个CIPKs家族成员，水稻CIPKs家族成员有30个。CBL-CIPK信号途径广泛参与植物高盐胁迫下的植物SOS信号转导。植物在盐胁迫下，细胞内Ca2+浓度增加，细胞膜上的Ca2+感受器S0S3/CBL4结合Ca2+并作用于激酶S0S2/CIPK24，S0S3-S0S2复合体被激活并磷酸化细胞膜Na+/H+逆转运载体S0S1，提高了 Na+/H+逆向转运能力，将细胞内过量的Na+排出以维持细胞内Na+平衡。在植物生长发育过程中钾(K+)起着重要的作用。植物对K+的吸收和转运主要是通过K+转运体。CBL-CIPK信号转导系统在调控植物低钾胁迫响应中起重要作用。在拟南芥中，CIPK23与CBLl或CBL9相互作用，磷酸化下游的K+通道AKTl，激活K+转运。CBLl与CBL9还可以与CIPK6、CIPK16相互作用，传递低钾信号、调控AKT1。CBL-CIPK还参与依赖ABA和非依赖ABA的信号转导。CBLl功能缺失突变体cbll对干旱、冷害和盐胁迫等多种非生物胁迫的敏感性并不依赖ABA，与CBLl高度同源的CBL9功能缺失突变体cbl9对非生物胁迫的敏感性则对ABA高度依赖。此外，除介导植物对外界环境的响应，CBL-CIPK系统还参与植物发育相关的过程以及调控植物其他的生理过程。
【发明内容】
[0006]本发明针对现有技术的不足，提供一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子及其编码基因与应用。
[0007]发明概述
[0008]本发明根据前期小麦盐、旱胁迫获得的表达谱芯片信息，选择在根和叶中表达明显受盐和旱诱导的蛋白激酶基因(探针)，并克隆了其含全长编码区的cDNA序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。分析表明，该基因编码CBL-CIPK类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，定名为TaCIPK33。通过转基因功能分析表明，该基因具有提高植物耐盐性和抗旱性的功能。这为深入理解小麦响应干旱、盐胁迫的分子机理提供了基础，同时该基因可应用于小麦等作物抗逆新种质的遗传改良。
[0009]发明详述
[0010]一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子的编码基因TaCIPK33，核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子的编码基因TaCIPK33序列全长1463个碱基，编码区有1332个碱基。
[0011]上述小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子由443个氨基酸残基组成。
[0012]一种插入上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重组载体。
[0013]一种转基因细胞系，含有上述重组载体。
[0014]一种转基因植株，含`有上述重组载体。
[0015]上述小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子的编码基因TaCIPK33、重组载体、转基因细胞系或转基因植株在培育耐盐、抗旱植物中的应用。
[0016]根据本发明优选的，所述的植物为小麦或烟草。
[0017]有益效果
[0018]本发明首次克隆到了小麦TaCIPK33基因，该基因编码CBL-CIPK类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并通过转基因功能分析证明了所述基因具有提高植物耐盐性和抗旱性的功能。本发明通过根瘤农杆菌介导的途径将该基因转入烟草中过量表达，与野生型烟草植株相比，含有本发明的TaCIPK33基因的转基因烟草后代植株具有更为明显的耐盐、抗旱能力。本发明的基因可为培育小麦等作物抗逆新品种提供理论依据和基因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1、为TaCIPK33基因全长cDNA序列的PCR扩增电泳结果照片；
[0020]其中:M、DNA分子量标准 Marker (Trans2k plus), 1、阴性对照，2、PCR 产物；
[0021]图2、NaCl、PEG胁迫处理后TaCIPK33基因在小麦山融3号幼苗根和叶中的RT-PCR分析的电泳结果照片；
[0022]其中:Actin为内参；Leaf为叶；Root为根；
[0023]A、根中TaCIPK33基因在200mM NaCl胁迫处理下的表达；
[0024]B、根中TaCIPK33基因在体积浓度为18%PEG6000胁迫处理下的表达；
[0025]C、叶中TaCIPK33基因在200mM NaCl胁迫处理下的表达；
[0026]D、叶中TaCIPK33在体积浓度为18%PEG6000胁迫处理下的表达；[0027]图3、构建的植物表达载体pROK I1-TaCIPK33的酶切验证电泳结果照片；
[0028]其中:M、DNA分子量标准 Marker (Trans2k plus)，1、pROKII 质粒，2、pROK I1-TaCIPK33 的 BamH I 和 KpnI 双酶切结果；
[0029]图4、TaCIPK33转基因烟草的再生过程照片；
[0030]其中:A、卡那霉素抗性芽在诱导培养基中的诱导与筛选，B、卡那霉素抗性芽在筛选培养基中生长；C、转基因烟草植株在温室正常生长；
[0031]图5、转基因烟草的PCR鉴定电泳结果照片；
[0032]其中:M、DNA分子量标准Marker (Trans2k plus)，1-11、转基因植株，12、阳性对照，13、水对照，14、野生型非转基因烟草植株；
[0033]图6、转基因烟草株系的表型鉴定照片；
[0034]其中:A、在含有IOOmM NaCl的MS培养基上竖直培养两周幼苗根长生长情况；
[0035]B、在含有IOOmM甘露醇的培养基上竖直培养两周幼苗根长生长情况；
[0036]A、B图中，左上为对照野生株系WT，右上为转基因株系S/T-8，左下为转基因株系S/T-9，右下为转基因株系S/T-10 ；
[0037]C、在含有IOOmM NaCl的MS培养基上种子萌发情况；
[0038]D、在含有IOOmM甘露醇的MS培养基上种子萌发情况；
[0039]C、D图中，上方为对照野生株系WT，下方为转基因株系S/T-10。
【具体实施方式】
[0040]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0041]生物材料来源
[0042]大肠杆菌DH5 α，北京全式金生物技术有限公司有售；
[0043]农杆菌LBA4404, Invitrogen 公司有售；
[0044]植物表达载体pROK II, Biovector中国质粒载体菌株基因库有售；
[0045]小麦山融3号，鲁农审字[2004] 030号，普通市售产品；
[0046]以下实施例中如无特别说明，使用的方法均为本领域常规方法，培养基均为本领域常规培养基。
[0047]实施例lTaCIPK33基因cDNA序列的克隆
[0048]TaCIPK33基因全长cDNA序列的克隆和序列测定
[0049]1.引物序列
[0050]根据小麦的SSH和表达谱芯片数据结果设计基因特异性引物，以小麦幼苗叶片cDNA第一条链为扩增目的基因的模版，扩增基因的全长cDNA，引物序列为:
[0051]TaCIPK-S:5/ CGACCTACCTCCTACCCTC3' ,SEQ ID N0.3
[0052]TaCIPK - A:5/ GCAAGATAGTTCCATTCCG3;。SEQ ID N0.4
[0053]2.PCR 反应体系(20 μ I)
[0054]依次加入10XPCR 缓冲液(含 Mg2+) 2.0 μ L, 2.5mM dNTPl.6 μ L，反转录 cDNA 第一链产物 I μ L，正向引物(TaCIPK-S) 0.5 μ L，反向引物(TaCIPK-A) 0.5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.2 μ L，加水至20 μ L。[0055] 3.PCR 反应程序为:94°C预变性 5min ;94°C变性 30Sec，62°C复性 30Sec，72°C延伸lmin, 30cycles ;72°C延伸 10min,4°C保存。
[0056]4.lwt%琼脂糖凝胶电泳
[0057]PCR扩增产物用lwt%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在1463bp处有一条目的带，如图1所示。
[0058]5.扩增目的片段的回收、克隆至PMD18-T载体
[0059]对扩增片段采用lwt%琼脂糖凝胶电泳后,使用TIANgel Midi Purification kit试剂盒回收目的基因片段即PCR产物，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。PCR产物与TaKaRa公司pMD18_T载体连接，获得连接产物，连接体系为:
[0060]IuL pMD18_T Vector, 4uL PCR 产物，5uL Ligation Mix ；
[0061]条件为16°C连接30分钟。
[0062]6.回收片段的克隆与测序
[0063]将全量的连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，挑取白色菌斑于37°C摇菌，提取已插入基因片段的质粒。
[0064](I)双酶切检测验证:用TaKaRa公司的Hind III和EcoR I内切酶酶切，操作如下:酶切体系20yL，包括2μ L缓冲液，14μ L已插入基因片段的质粒，IyL HindIII内切酶，IyL EcoRI内切酶，补水2 μ L。在37°C水浴中4个小时，电泳检测酶切结果。
[0065](2)将连接载体的阳性克隆的菌液送测序公司测序，确保正确无误，测序结果如SEQ ID N0.1所示，由1463个碱基组成，命名为TaCIPK33。
[0066]实施例2基因的表达分析
[0067]NaCl、PEG胁迫处理条件下TaCIPK33基因的表达分析
[0068]1.材料处理
[0069]选取饱满的小麦山融3号种子，进行正常萌发。
[0070]挑选生长至两叶一心、情况大体一致、健壮的山融3号小麦进行如下胁迫处理:200mM NaCl泡根处理48h后恢复48h ;体积百分浓度为18%PEG6000溶液浸根处理48h后恢复48h，对照为正常条件下健康植株。分别在Oh、0.511、111、311、611、1211、2411、4811、恢复2411和恢复48h取样，-70°C保存。取山融3号小麦植株的胁迫处理不同时间点的根和叶，Trizol法提取小麦总RNA。
[0071]2.Trizol法提取小麦总RNA
[0072]以小麦山融3号10天苗龄的幼苗叶片为材料
[0073](I)将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末，将粉末装入1.5mL离心管中，每IOOmg材料迅速加入Iml的Invitrogen公司的TRIzol提取液,剧烈震荡15秒，混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；
[0074](2)加入 100uL2M 醋酸钠(PH4.0)，温育 2-3 分钟；
[0075](3)加入0.2ml氯仿(chloroform),剧烈振荡15秒,温育2-3分钟；
[0076](4) 4°C,12000rpm离心15分钟，取上清液移至新的1.5mL离心管中；
[0077](5)加入800 μ L氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟，温育2 — 3分钟；
[0078](6) 4°C, 12000rpm离心15分钟，取上清液移至新的1.5mL离心管中；
[0079](7)加入500 μ L异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟；[0080](8) 4°C，12000rpm离心10分钟，吸除上清液；
[0081](9)加入Im L预冷的体积百分比为75%的乙醇溶液，蜗旋震荡。4°C，7500rpm离心5分钟，弃上清，收集沉淀；
[0082](10)重复用体积百分比为75%的乙醇溶液洗涤RNA沉淀一次；
[0083](11)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适量的DEPC水(一般为20 μ L)溶解沉淀(或体积百分比为75%的乙醇溶液中保存(置-80°C冰箱中保存备用)；
[0084](12)取I μ L RNA样品，lwt%琼脂糖凝胶电泳检测，于紫外凝胶成像系统中成像，鉴定RNA是否降解及粗略的浓度。
[0085]3.第一链cDNA的合成
[0086]米用Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行，反应步骤如下:
[0087]首先，将mRNA反转录成第一链cDNA,所用反转录酶为Fermentas公司的RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit,反应体系为 20 μ L。依次加入 I μ L oligo (dT) 18primer(lOOuM), I μ g Total RNA和DEPC水至10 μ L，65°C水浴变性5min,冰上急冷，稍离心；然后依次加入 I μ L RNase Inhabitor (20U/uL), 4 μ L5x Reaction Buffer, 2 μ L dNTP Mixture(IOmM)IyL M-MuLV ReverseTranscriptase (200U/uL), 4 μ L RNase Free ddH20,混匀；
[0088]然后在PCR仪上按照“42°C，60min ；70°C，5min ；4°C，保存”的程序运行；反转录获得小麦cDNA的第一条链，于_20°C保存。
[0089]4.PCR反应体系
[0090]用山融3号小麦cDNA为模板，以TaActin-S和TaActin-A作为扩增引物，获得558bp左右的actin内参产物片段。根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA的模版量。
[0091](I)内参Actin引物序列:
[0092]TaActin-S5/ AGCCATACCGTGCCAATC3'
[0093]TaActin-A5/ AGAGCCTCCAATCCAGAC3'
[0094](2)反应体系如下:TaqMixl0uL,模板 x uL, TaActin-S0.5, TaActin-A0.5,补水至总体系20 μ Lo
[0095](3) PCR 反应程序:94 °C 5min ；94 °C 30Sec，58 °C 30Sec，72 °C lmin, 30cycles ；72°C IOmin ;4°C保存。
[0096]lwt%琼脂糖凝胶电泳检测表达分析,结果如图2所示。
[0097]实施例3CaMV35S启动子驱动的过量表达植物表达载体的构建
[0098]植物表达载体pROK II是含有CaMV35S启动子和NPTII基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶BamH I和Kpn I位点。根据基因TaCIPK33的cDNA编码区序列，设计包含完整ORF的基因特异性引物，引物序列=TaCIPK-Sl加入BamH I (GGATCC)位点，TaCIPK-Al 加入 Kpn I (GGTACC)位点，
[0099]TaCIPK-S15/ CGCGGATCCCGACCTACCTCCTACCCTC3' , SEQ ID N0.5
[0100]TaCIPK-A15/ CGGGGTACCGCAAGATAGTTCCATTCCG3' , SEQ ID N0.6
[0101]用该对引物扩增基因的cDNA序列，扩增出1463bp的基因片段，并克隆至TaKaRa公司的PMD18-T载体上。然后用限制性内切酶BamH I和Kpn I分别双酶切空载体pROK II和携带目的基因片段的PMD18-T载体，分别回收载体大片段和TaCIPK33基因片段，16°C过夜连接，得到重组质粒植物表达载体pROK I1-TaCIPK33。
[0102](I)空载体pROK II和携带目的基因片段的T-载体BamH I内切酶和Kpn I内切酶双酶切
[0103]酶切反应体系(20 μ L):
[0104]BamH I 内切酶IyL
[0105]Kpn I 内切酶I μ L
[0106]空载体pROKII
[0107](或目的基因片段)5yL
[0108]IOXBuffer2 μ L
[0109]补ddH20 至20 μ L，
[0110]在37 °C恒温水浴锅温育2小时；
[0111](2)酶切产物电泳与回收
[0112]双酶切反应完成后，将酶切产物进行0.8wt%琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶试剂盒回收载体大片段和TaCIPK基`因片段；
[0113](3)连接
[0114]将经过双酶切的载体大片段和目的基因片段按照体积比1:4的比例进行16°C过夜连接，反应体系如下(25μ L):TaCIPK基因片段10μ L，pR0K II载体大片段4 μ L，IOXT4DNALigase buffer2.5 μ L, T4DNA Ligasel μ L，补水至 25 μ L ; 16°C连接过夜；
[0115](4)转化
[0116]将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化菌落在含Kan50 μ g/ml的LB固体平板上37°C培养16小时；
[0117](5)阳性重组子的酶切鉴定
[0118]挑取白色菌斑于37°C摇菌，提取质粒，BamH I内切酶和Kpn内切酶双酶切检测验证，酶切反应体系同实施例3中的(I)步骤，酶切产物经0.8wt%琼脂糖凝胶电泳，检测到合适大小的目的基因条带和载体片段条带，说明TaCIPK基因已经成功连接到pROK II载体，制得重组表达载体质粒DNA。结果如图3所示。将连接好的重组载体进行测序，确保正确无误。
[0119]实施例4农杆菌感受态的制备与转化
[0120]1.农杆菌感受态细胞的制备
[0121](I)从YEP平板(含50 μ g/ml利福平)上挑取农杆菌LBA4404单菌落，接种于含50 μ g/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm，28°C下培养过夜；
[0122](2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中，相同条件下培养至OD600 M 0.5；
[0123](3)菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 离心 IOmin,收集菌体；
[0124](4)菌体重悬于冰浴的 IOml0.15mol/L 的 NaCl 中，4°C 5000rpm 离心 lOmin，收集菌体；
[0125](5)菌液重新悬浮于Iml20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，将菌液以每管200 μ L分装在1.5ml Eppendorf管中，液氮速冻lmin, -70°C保存备用。
[0126]2.冻融法转化农杆菌LBA4404
[0127](I)冰上融化农杆菌感受态细胞，加入I μ g重组表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min ；
[0128](2)液氮速冻lmin,迅速移至37°C保温3min ；
[0129](3)加入无抗生素的液体YEP800 μ L，28°C震荡培养4hr ；
[0130](4) 7000rpm离心30s，收集菌体，涂于含有50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平板上，28°C倒置暗培养2~3天。
[0131]3.阳性菌落PCR鉴定
[0132]菌落PCR所用引物同实施例1，方法及程序同实施例1中的步骤2。
[0133]实施例5转基因功能验证烟草转化、筛选及表型分析
[0134]1.叶盘转化法转化烟草
[0135](I)烟草种子于体积百分比为75%的乙醇溶液消毒lmin，无菌水冲洗3~5次；将次氯酸钠和水以1:4的质量比稀释，对种子消毒lOmin，无菌水冲洗5次，均匀铺洒于1/2MS。基本培养基上，使其发芽。
[0136](2)待种子发芽(约两周)后，将其转移到单独的瓶中(含1/2MS)，生长4~5周，待植株长出足够的叶子以供转化。
[0137](3)挑取农杆菌(携带重组表达载体质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50 μ g/ml卡那霉素，50 μ g/ml利福平的YEP液体培养基中，280C，200rpm振荡培养约24h，至对数生长期。
[0138](4)将菌液6000rpm离心6min，收集菌体，MS0液体培养基重悬。
[0139](5)取烟草叶片，剪成小块(0.5X0.5cm)，将剪好的烟草叶片放于重悬的菌液中
1.5min,不断振荡，取出后用无菌滤纸吸干水分，将其整齐紧密地排列在MS分化培养基上，28°C，暗培养2d。
[0140](6)暗培养两天后，将叶片松散地排列在MS选择培养基上，280C，光照时间16h/d，
每隔两周更换一次培养基。
[0141](7)待其长出丛生芽时，将其切下放入伸长培养基上，使其伸长。
[0142](8)丛生芽长至3~5cm时，转移到生根培养基，促其生根。
[0143](9)待根系发育好后，将苗洗根移入盛有无菌土的花盆中，盖地膜3d。
[0144](10)光下培养，长至一定程度移到大盆中，温室常规管理，收获Ttl代种子。结果如图4所示。
[0145]2.转基因烟草阳性植株的筛选
[0146]Ttl代种子用7.5wt%次氯酸钠溶液(包括7.5wt%次氯酸钠和0.01wt%Triton_X100)消毒后，播种在MS选择培养基(50mg/L卡那霉素)上，培养室中培养10天，挑选卡那霉素抗性植株(长出真叶1-2对，根伸长至培养基中)并移栽到营养钵中，培养直至种子成熟，采用同样的方法筛选T1代种子得到T2代植株，并在T1代植株中挑选抗性比为3:1的单拷贝插入株系，在T2代选择抗性部分的纯合株系，即:纯合T2代株系，将纯合T2代株系进行转基因烟草的分子检测和表型鉴定。
[0147]单拷贝插入的纯合株系的获得为本领域常规步骤:将收获的T1代种子播种在添加有卡那霉素的MS培养基上，非转基因种子萌发后会白化、死亡，转基因种子萌发后为正常的绿色苗，通过卡方(X2)测验，计算绿色苗与白化死亡苗的比例，如果外源基因是单拷贝插入到受体烟草中，那么绿色苗与白化死亡苗的比例就是3:1，即单拷贝插入的转基因株系，否则就不是符合要求的转基因后代(即符合孟德尔遗传规律)。收获单拷贝插入的转基因株系的种子，继续在添加有卡那霉素的MS培养基上筛选，完全是绿色苗的为纯合体，即纯合的T2代株系。转基因T3代株系为单拷贝纯合株系自交传代获得。
[0148]3.转基因烟草的PCR鉴定
[0149](I) CTAB法提取烟草叶片基因组DNA
[0150]①取IOOmg左右的新鲜叶片，放入1.5ml离心管中，液氮速冻，研磨，加入600 μ L预热至65°C的2XCTAB提取缓冲液，上下颠倒混匀，置于65°C水浴中静置30min ;其间不断轻摇，使CTAB提取液与植物材料充分混匀；
[0151 ] ②混合物冷至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，室温静置15min，4°C，12000rpm 离心 IOmin ；
[0152]③取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，4°C，12000rpm离心IOmin ；
[0153]④取上清，加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.3)和0.7倍体积的异丙醇，混匀，室温静置 15min,4°C, 12000rpm 离心 15min,沉淀 DNA ；
[0154]⑤75%乙醇洗沉淀两次。弃上清，超净台干燥数分钟
[0155]⑥沉淀溶于适量TE缓冲液中，于_20°C保存。
[0156](2)转基因烟草的PCR扩增
`[0157]以上述提取的烟草基因组DNA为模板，用基因特异性引物(同实施例1)进行PCR扩增。
[0158]PCR反应体系同实施例1中的步骤2，PCR反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性 30Sec，62°C复性 30Sec，72°C延伸 lmin, 30cycles ;72°C延伸 10min，4°C保存。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测到在转基因烟草植株中扩增出1463bp左右的目的条带，在转空载体的植株中和灭菌水为阴性对照未见扩增条带，结果如图5所示。
[0159]4.转基因烟草的表型鉴定
[0160](I)烟草的种植
[0161]T3代单拷贝纯合烟草株系的种子用7.5wt%次氯酸钠溶液(包括7.5wt%次氯酸钠和0.01wt%Triton-X100)消毒10分钟，然后用无菌水漂洗5~6次，点播于MS平板上，然后移植到营养钵中(营养土与蛭石按等比例混合)，25°C培养。
[0162](2) NaCl和干旱胁迫处理
[0163]根长统计
[0164]将萌发2天的烟草幼苗(对照WT及转基因株系S/T-8、S/T-9、S/T_10)小心移至含有IOOmM NaClUOOmM甘露醇的MS培养皿中，竖直培养两周观察统计根长长度，结果表明转TaCIPK33基因的烟草植株的根长明显比野生型对照植株的根长长(如图6A、6B所示)。
[0165]萌发率统计
[0166]将转基因后代烟草种子(S/T-10)和野生型烟草种子(WT)用次氯酸钠消毒10分钟后，无菌水漂洗5次，点播于分别含有IOOmM NaClUOOmM甘露醇的MS培养皿中，培养两周后，分别统计种子的萌发率，结果发现转TaCIPK33基因烟草后代的种子萌发率高于野生型种子的萌发率(如图6C、6D所不)。
[0167]结果分析 [0168]由上述实验结果可以得出，本申请所述基因TaCIPK33编码CBL-CIPK类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与植物对干旱、高盐逆境的响应。该基因TaCIPK33过量表达后，转基因植株能够产生耐盐抗旱的特性。
【权利要求】
1.一种小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子的编码基因TaCIPK33，核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.权利要求1所述小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子，氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.一种插入SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重组载体。
4.一种转基因细胞系，含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种转基因植株，含有权利要求3所述的重组载体。
6.权利要求1所述小麦CBL-CIPK类抗逆调节因子的编码基因TaCIPK33、权利要求3所述重组载体、权利要求4所述转基因细胞系或权利要求5所述转基因植株在培育耐盐、抗旱植物中的应用。
7.如权利要求6所述的应`用，其特征在于，所述的植物为小麦或烟草。
【文档编号】A01H5/00GK103555740SQ201310511236
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】单雷, 徐平丽, 彭振英, 夏光敏, 唐桂英, 柳展基 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心