一种提高粳稻花药培养效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高粳稻花药培养效率的方法，该方法为：首先按照粳稻花药培养基母液配方配制粳稻花药培养基母液，然后利用各种母液配制不同时期所用的诱导培养基、分化培养基、生根培养基，再将上述不同时期的培养基分别相对应的运用到粳稻花药愈伤组织的诱导、绿苗分化、生根三步成苗过程中。采用本发明后能够提高粳稻花药培养的成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率。
【专利说明】一种提局粳稻花药培养效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及粳稻花药培养领域，具体说是一种提高粳稻花药培养效率的方法【背景技术】
[0002]花药培养是一种有效快速稳定变异材料的手段，自20世纪70年代开展水稻花药培养育种研究以来，花药培养已经发展成为一种成熟而又实用的水稻育种辅助手段；但同时花药培养存在愈伤组织诱导率和绿苗分化率低、成苗率不高的缺点。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术中存在的问题与不足，本发明的第一目的在于提供一种粳稻花药培养基母液以及利用该母液配制成的诱导培养基、分化培养基、生根培养基。
[0004]本发明的另一目的在于提供一种利用上述各培养基提高粳稻花药培养效率的方法。
[0005]为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案如下:
[0006]一种粳稻花药培养基母液，包括母液A、母液B、母液C、母液D ;其中:
[0007]母液A包括如下组分:按10倍浓度(即将母液A用水稀释10倍后母液A工作液浓度)计算，KN0330g/L、ΝΗ4Ν0316.5g/L、KH2P045g/L、MgSO4.7Η203.7g/L、CaCl24.4g/L ；
[0008]母液B包括如下组分:按100倍浓度(即将母液B用水稀释100倍后母液B工作液浓度)计算，ZnSO4.7H20500mg/L、MnSO4.H201000mg/L、H3B03500mg/L、CuSO4.5H202.5mg/L、KI83mg/L、Na2MoO4.2H2025mg/L、CoCl2.6H202.5mg/L ；
[0009]母液C包括如下组分:按100倍浓度(即将母液C用水稀释100倍后母液C工作液浓度)计算，Na2-EDTA5.6g/L、Fe2 (SO4) 3.7H204.3g/L ；
[0010]母液D包括如下组分:按100倍浓度(即将母液D用水稀释100倍后母液D工作液浓度)计算，肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、盐酸吡唆醇0.05g/L、甘氨酸
0.2g/L。
[0011]利用上述粳稻花药培养基母液配成的诱导培养基，包括如下组分:100ml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,5ml浓度为lmg/ml的2.4_D、鹿糖40g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇20g/L、0.lmg/mL的玉米素0.8ml ；pH为5.8。
[0012]上述诱导培养基的制备方法，具体如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,5ml的浓度为lmg/ml的2.4-D,倒入IOOOml的锥型瓶中，加水至600-700ml,混匀；再将水解酪蛋白lg、琼脂6g、鹿糖40g、山梨糖醇20g,倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8，得到混合溶液；用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将上述混合溶液移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，待混合溶液温度降至60-70°C，加入经过过滤除菌的0.lmg/mL玉米素0.8ml，混匀，缓缓倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了诱导培养基的配制。
[0013]利用上述粳稻花药培养基母液配成的分化培养基，包括如下组分:100ml的母液、A、10ml白勺母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml浓度为2mg/ml的6_BA、0.5ml浓度为
0.5mg/ml的NAA, Iml浓度为2mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇10g/L ;pH为5.8。
[0014]上述分化培养基的制备方法，具体如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml浓度为2mg/ml的6_BA、0.5ml浓度为0.5mg/ml的NAA, Iml浓度为2mg/ml的苯乙酸倒入IOOOml的锥型瓶中，加水到600_700ml的位置,混匀；然后将鹿糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白lg、山梨糖醇IOg倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml,调节pH=5.8 ;用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将分化培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了分化培养基的配制。
[0015]利用上述粳稻花药培养基母液配成的生根培养基，包括如下组分:100ml的母液AUOml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/L ；pH为5.8。
[0016]上述生根培养基的制备方法，具体如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、10ml的母液D倒入IOOOml的锥型瓶中，加水到600_700ml的位置，混匀；再将蔗糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白lg、山梨糖醇10g、多效唑2mg倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8 ;用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将生根培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养瓶中，待其自然凝固就完成了生根培养基的配制。
[0017]为了解决上述第二目的， 申请人:经过多年反复试验，在诸多花药培养方案中发现，以下方法可以很好地实现发明目的，具体如下:
[0018]一种提高粳稻花药培养效率的方法，该方法包括以下步骤:
[0019]I)按照上述粳稻花药培养基母液配方配制粳稻花药培养基母液；备用；
[0020]2)取孕穗期剑叶叶枕距2_5cm的幼穗，在8~10°C预处理7_10d，消毒；取花粉处于单核时期的花药接种在上述诱导培养基上进行离体培养；接种结束后将述诱导培养基移至智能光照培养箱，关闭培养箱中所有灯管，并用报纸或黑布遮盖培养箱透光处，防止外界光线射入，设定箱内温度为24-26°C，进行为期21-35天的暗处理，形成了愈伤组织；
[0021]3)将步骤2)中得到的愈伤组织转接到上述分化培养基上；智能光照培养箱，设定温度为24-26°C，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天；
[0022]4)愈伤组织在上述分化培养基上经过15天的分化形成根和芽，长出绿色小苗，将绿色小苗从分化培养基中转接到生根培养基上；智能光照培养箱，设定温度为27°C，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天，得到试管苗；
[0023]5)炼苗移植:绿色小苗转入上述生根培养基培养3日后，所有试管苗均开始发根，当试管苗绿苗长至7~8cm，，具有5~10条长约0.5~Icm长的根时，从试管中取出绿苗，洗去根部培养基，清水培养；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮阳网遮盖；一周后移种大田。
[0024]本发明具有以下有益效果:本发明方法适用于常规粳稻花药愈伤组织的诱导、绿苗分化、生根三步成苗过程，能够提高粳稻花药培养的成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率。【具体实施方式】
[0025]本发明一种提高粳稻花药培养效率的方法包括以下步骤:
[0026]( I)粳稻花药培养基母液的配制
[0027]花药培养所使用的培养基母液主要包括四个部分:母液A、母液B、母液C、母液D，此外还包括一些植物生长调节剂。下表是其主要成分及其浓度:
[0028]表1:母液A:大量元素，按10倍浓度计算
[0029]
[0030]表1中10倍MS培养基母液浓度作为对照组。10倍母液A浓度指的是母液A用水稀释10倍后的母液A工作液浓度。
[0031]表2母液B:微量元素，按100倍浓度计算
[0032]
[0033]
[0034]表2中100倍MS培养基母液浓度作为对照组。100倍母液B浓度指的是母液B用水稀释100倍后母液B工作液浓度。
[0035]表3母液C:铁盐，按100倍浓度计算
[0036]
【权利要求】
1.一种粳稻花药培养基母液，其特征在于，包括母液A、母液B、母液C、母液D ;其中 母液A包括如下组分:按10倍浓度计算，KNO3 30 g/L,NH4NO3 16.5g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4.7H20 3.7g/L、CaCl2 4.4g/L ； 母液B包括如下组分:按100倍浓度计算，ZnSO4.7Η20 500mg/L ,MnSO4.Η20 1000mg/UH3BO3 500mg/L、CuSO4.5Η20 2.5mg/L、KI 83mg/L、Na2MoO4.2H20 25mg/L、CoCl2.6H202.5mg/L ； 母液C包括如下组分:按100倍浓度计算，Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2(SO4)3.7H20 4.3g/L ； 母液D包括如下组分:按100倍浓度计算，肌醇10g/L、烟酸0.05g/L、盐酸硫胺素0.05g/L、盐酸吡哆醇0.05g/L、甘氨酸0.2g/L。
2.根据权利要求1所述的粳稻花药培养基母液配成的诱导培养基，其特征在于，包括如下组分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D,5ml浓度为Img/ml的2.4-D、鹿糖40g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇20g/L、0.1mg/mL的玉米素0.8ml ；pH 为 5.8。
3.根据权利要求2所述的诱导培养基的制备方法，其特征在于，取100ml的母液Α、10ml白勺母液B、10ml白勺母液C、10ml的母液D,5ml的浓度为1mg/ml的2.4-D,倒入1000ml的锥型瓶中，加水至600-700ml,混匀；再将水解酪蛋白lg、琼脂6g、鹿糖40g、山梨糖醇20g,倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8，得到混合溶液；用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将上述混合溶液移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，待混合溶液温度降至60-70°C，加入经过过滤除菌的0.1mg/mL玉米素0.8ml，混匀，缓缓倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了诱导培养基的配制。
4.根据权利要求1所述的粳稻花药培养基母液配成的分化培养基，其特征在于，包括如下组分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D,2ml浓度为2mg/ml的6-BA、0.5 ml浓度为0.5 mg/ml的NAA, 1 ml浓度为2 mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇10g/L ；pH为5.8。
5.根据权利要求4所述的分化培养基的制备方法，其特征在于，取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D, 2ml浓度为2mg/ml的6-ΒΑ、0.5 ml浓度为0.5mg/ml的NAA, 1 ml浓度为2 mg/ml的苯乙酸倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀；然后将蔗糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇IOg倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8 ;用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将分化培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养皿中，待其自然凝固就完成了分化培养基的配制。
6.根据权利要求1所述的粳稻花药培养基母液配成的生根培养基，其特征在于，包括如下组分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/ L ;pH为5.8。
7.根据权利要求6所述的生根培养基的制备方法，其特征在于，取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D倒入1000ml的锥型瓶中，加水到600-700ml的位置，混匀；再将鹿糖30g、琼脂6g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10g、多效唑2mg倒入锥型瓶中，加热混匀，定容至1000ml，调节pH=5.8 ;用玻璃纸密封锥型瓶口后进行灭菌；灭菌结束以后，将生根培养基移至已经过紫外光杀菌的净化工作台上，倒入已经经过灭菌的培养瓶中，待其自然凝固就完成了生根培养基的配制。
8.一种提高粳稻花药培养效率的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 1)按照权利要求1所述粳稻花药培养基母液配方配制粳稻花药培养基母液；备用； 2)取孕穗期剑叶叶枕距2-5cm的幼穗，在8~10°C预处理7_10d，消毒；取花粉处于单核时期的花药接种在所述诱导培养基上进行离体培养；接种结束后将述诱导培养基移至智能光照培养箱，关闭培养箱中所有灯管，并用报纸或黑布遮盖培养箱透光处，防止外界光线射入，设定箱内温度为24-26°C，进行为期21-35天的暗处理，形成了愈伤组织；其中所述诱导培养基包括如下组分:100ml的母液A、IOml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D，5ml浓度为lmg/ml的2.4-D、鹿糖40g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白I g/L、山梨糖醇20g/L、0.1mg/mL的玉米素0.8ml ；pH为5.8 ; 3)将步骤2)中得到的愈伤组织转接到分化培养基上；智能光照培养箱，设定温度为24-26°C，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天；其中所述分化培养基包括如下组分:100ml的母液A、IOml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml浓度为2mg/ml的6-BA、0.5 ml浓度为0.5 mg/ml的NAA, I ml浓度为2 mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、琼脂6g/L、水解 酪蛋白I g/L、山梨糖醇10g/L ；pH为5.8 ; 4)愈伤组织在分化培养基上经过15天的分化形成根和芽，长出绿色小苗，将绿色小苗从分化培养基中转接到生根培养基上；智能光照培养箱，设定温度为27°C，设定光照时间为14小时/天，暗处理时间8小时/天，得到试管苗；其中所述生根培养基包括如下组分:IOOml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、琼脂6g/L、水解酪蛋白I g/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/ L ;pH为5.8 ; 5)炼苗移植:绿色小苗转入生根培养基培养3日后，所有试管苗均开始发根，当试管苗绿苗长至疒8cm，，具有5~10条长约0.5~Icm长的根时，从试管中取出绿苗，洗去根部培养基，清水培养；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮阳网遮盖；一周后移种大田。
【文档编号】A01H4/00GK103461141SQ201310451345
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】余波, 林添资, 龚红兵, 景德道, 周义文, 盛生兰, 李闯, 钱华飞, 曾生元 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所