一种构建人银屑病小鼠模型的方法及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及动物模型【技术领域】，具体涉及一种构建人银屑病小鼠模型的方法，以及其在药物筛选中的应用。本发明构建人银屑病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打靶技术，通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠，并将所述标记小鼠与在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交，筛选，获得银屑病小鼠模型。本发明的人银屑病小鼠模型具有构建方法简便、经济，与人银屑病表现高度相似等优点，并且动物模型使用方便，极具市场价值和医药用途的前景。
【专利说明】一种构建人银屑病小鼠模型的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物模型【技术领域】，具体涉及一种构建人银屑病小鼠模型的方法，以 及其在药物筛选中的应用。
【背景技术】
[0002] 银屑病是人类最常见的一种皮肤疾病。典型的皮肤表现是境界清楚的具有银白色 鳞屑的红色斑块。轻者可表现为几个银币大小的肘膝部位斑块，重者也可以全身皮肤受累。 难于根治，易复发是该病在临床上的一个重要特征。银屑病的病因十分复杂。到目前为止， 该病的具体病因还没有定论，研究提示该病的发生主要与遗传因素，感染，代谢障碍，免疫 功能障碍，以及内分泌障碍等多种因素的共同作用有关。
[0003] 该病的组织病理表现为表皮角化过度伴有角化不全，角质层内或棘层上部可见中 性粒细胞聚集，分别称为Munro微脓肿和Kogoji海绵状微脓肿，棘层增厚，表皮突下延，末 端常增宽，真皮乳头呈杵状，顶部变薄，血管扭曲扩张，真皮上部慢性炎细胞浸润。
[0004] 银屑病的病理生理的特点在于各种细胞间非常复杂的相互作用，特别是表皮细胞 与各种免疫细胞之间的相互影响。几十年来，关于是表皮细胞还是免疫细胞缺陷引起银屑 病的争论还在继续。
[0005] 由于极少有自发的动物银屑病，如何制备人银屑病动物模型长期以来都是该病研 究的一个主要挑战。目前最可靠的动物模型是将患者受累皮肤移植到联合免疫缺陷的小 鼠。该模型虽然忠实地模拟了银屑病的局部表现，但却排除了全身免疫系统的影响。另外， 该模型制备方法复杂，材料来源有限，保存时间短，因此难以大规模地使用。
[0006] 近来，Van der Fits L等博士发现表皮涂抹TLR7/8激动剂Imiquimod可引起明 显的银屑病样的皮肤病理表现，并有证据提示与人银屑病相似，Thl7和树突状细胞在引起 这些病理方面有非常重要的作用（J Immun〇1182:5836-45)。然而，该模型虽然制备方便， 但最近发现，成功用于人银屑病治疗的TNF抑制剂反而可能促进Imiquimod引起的皮肤病 理表现（Int J Immunopathol Pharmacol. 24:509-15.)，说明该模型与人银屑病在致病机 理上可能有很大的不同。通过基因改造，目前已建立了多种银屑病的小鼠模型。然而根 据 Martha-Estrella Garcia-Perez 等博士（Recent Patents on InflammationMllergy Drug Discovery2012, 6, 3-21)以及 Frank 0? Nestle 等博士（New England Journal of Medicine2009,361 :496-509)最近所作的综述，这些模型都有一些不同的缺陷。
[0007] 例如，转录因子NF-KB在慢性炎症反应中发挥非常关键的作用。IKK2是NF-KB 信号通路被胞外刺激激活所必需的一种蛋白激酶。正常情况下，NF-K B与抑制蛋白I K B结 合而被留在细胞浆中。当细胞受到刺激后，IKK2被激活进而磷酸化IkB，并引起后者被泛 素系统识别和降解。因而导致NF-K B被释放出来，进入细胞核发挥其转录因子功能引起一 系列的炎症因子的表达，引起或放大炎症反应。现有技术分别改造IKK2/NF-K B信号通路 上多个不同的基因都出现了银屑病样的病理表现（Vet Path〇145 :563-575)，充分说明了该 信号通路在银屑病中的关键作用。Haase博士的实验室首先发现表皮特异的IKK2基因敲除 小鼠可以引起全身性的银屑病样病灶（Nature. 417:861-6)。组织学分析显示这些病灶与人 银屑病的病理改变非常相似：表皮细胞增生，颗粒层缺失，局部角化不全，真皮中巨噬细胞， T细胞，肥大细胞以及粒细胞的浸润，粒细胞也侵入表皮并形成微脓肿。然而，这些小鼠在出 生后不久就死亡，限制了该小鼠作为银屑病动物模型的应用。这个实验室还培育出了可诱 导的表皮特异IKK2基因敲除小鼠（J Invest Dermatol. 126:614-20.)。但这些小鼠有明显 的非特异性的基因敲除，给这些小鼠作为银屑病动物模型带来了一个非常不利的因素。
[0008] 可见，人们需要更多的其它简便、经济、与人银屑病表现高度相似的动物模型，用 于研究该病的发病机制和筛查对治疗这种疾病的可能有效的候选药物。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简便、经济的人银屑病小鼠模 型的建立方法，并采用本发明构建的人银屑病小鼠模型用于银屑病治疗药物的筛选，可以 简便、快速和高效的实现对抗银屑病药物的定性和/或定量评价。
[0010] 本发明首先公开了一种构建人银屑病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打靶 技术，将IKK2基因两侧带有同向IoxP位点的标记小鼠，与在组织特异性启动子SM22的控 制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得银屑病小鼠模型。
[0011] 以Cre/LoxP系统与基因打祀技术相结合的条件性基因打祀（conditional gene targeting)策略主要是运用DNA重组方法来构建打靶基因置于同向LoxP之内的打靶载 体，经在ES细胞(胚胎干细胞)上同源重组及筛选，将携带该载体的小鼠与受控于组织特 异性启动子的Cre基因的转基因小鼠交配，经Cre介导重组，即可获得靶基因在某一组织 器官上缺失的基因敲除小鼠。
[0012] 进一步的，所述人银屑病小鼠模型的构建步骤如下：
[0013] 1)构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向IoxP位点的 标记小鼠；
[0014] 2)构建Cre小鼠：构建在组织特异性启动子SM22的作用下表达Cre重组酶的Cre 小鼠；
[0015] 3)将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选，获得剔除IKK2基因的纯合子小鼠即为人银 屑病小鼠模型。
[0016] 本发明所述剔除IKK2基因的纯合子小鼠并不是在小鼠所有细胞基因组上都存在 基因的缺失，而只是在受SM22启动子调控的特定组织中缺失，是IKK2基因被条件性敲除的 纯合子小鼠。
[0017] 较优的，所述人银屑病小鼠模型的构建步骤具体为：
[0018] 1)构建标记小鼠：将含有L〇X-IKK2-L〇X基因片段的载体转化胚胎干细胞，使其与 胚胎干细胞的IKK2基因组发生同源重组；然后将同源重组后的阳性胚胎干细胞植入胚胎， 产生IKK2基因两侧带有IoxP位点的后代即为标记小鼠；
[0019] 2)构建Cre小鼠：通过转基因技术将表达Cre重组酶的基因引入基因组中，并位 于组织特异性基因启动子SM22的控制下，获得在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre 重组酶的Cre小鼠；
[0020] 3)将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选头部出现银屑病样病灶并剔除了 IKK2基因的 纯合子小鼠，即为人银屑病模型小鼠。
[0021] 较优的，所述启动子SM22含有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0022] Cre是来源于Pl噬菌体ere基因所编码的一个38ku蛋白，属于Int家族。它可 识别Pl基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点，并根据LoxP的方 向性，可在各种底物上介导三种不同的重组事件：a.同向位点之间序列的缺失；b.插入序 列；c.两个反向位点之间序列颠倒。
[0023] 靶基因两侧带有同向IoxP位点的标记小鼠的构建，以及组织特异性启动子控制 下的Cre小鼠的构建均属于现有技术。本发明所针对的靶基因为IKK2基因，Cre重组酶受 启动子SM22的控制特异性表达，条件性剔除小鼠体内特定部位的IKK2基因。本发明实施 例中，标记小鼠采用的是IKK2fWf1°x转基因小鼠，Cre小鼠为SM22-Cre小鼠，均为现有的已 构建小鼠。
[0024] 本发明其次公开了一种人银屑病小鼠模型，由前述方法制备获得。
[0025] 本发明的人银屑病小鼠模型，其体内受SM22启动子控制的IKK2基因的表达被选 择性的抑制，小鼠在头部出现人银屑病样病灶。
[0026] 银屑病样的病理表现：典型的皮肤表现是境界清楚的具有银白色鳞屑的红色斑 块。
[0027] 本发明还公开了前述构建人银屑病小鼠模型的方法，以及前述人银屑病小鼠模型 在制备或筛选银屑病治疗药物中的应用。
[0028] 本发明最后一方面公开了一种筛选银屑病治疗药物的方法，为将银屑病治疗备选 药物施用于前述人银屑病小鼠模型的病灶部位；通过比较用药前后小鼠头部的银屑病面积 严重指数（Psoriasis Area Severity Index, PASI)的变化，筛选出使小鼠头部的银屑病面 积严重指数减小的药物做为银屑病治疗药物。
[0029] 所述银屑病面积严重指数的计算方法如下：
[0030] PASI=发红面积X发红严重程度+增厚面积X增厚严重程度+多鳞面积X多鳞 严重程度
[0031] 其中，发红面积为发红病灶面积占头部总面积的百分比Xioo;增厚面积为增厚 病灶面积占头部总面积的百分比X 10 0 ;多鳞面积为多鳞病灶面积占头部总面积的百分 比XlOO ;发红严重程度、增厚严重程度、多鳞严重程度分别根据病灶的病变严重程度对每 个类型的病灶进行打分，包括：1 (分）为轻微，2 (分）为严重。
[0032] 计算发红面积、增厚面积、以及多鳞面积的方法可以为：对小鼠进行腹腔注射戊巴 比妥钠（67 ii g/g小鼠体重),待小鼠完全麻醉后,摄取头部照相,然后,利用Image J程序计 算出病灶面积占头部总面积的百分比。
[0033] 本发明的提供了一种简便、经济、与人银屑病表现高度相似的皮肤炎症小鼠模型。 本发明方法的建立是基于SM22-Cre只在小鼠特殊部位的皮肤表达的最新发现。SM22-Cre 的表达被认为是平滑肌特异的；但是本发明却发现SM22-Cre在皮肤中只在小部分地方表 达。由于全部皮肤IKK2的敲除会引起小鼠在出生后不久死亡，因而极大地限制了它们作 为一个动物模型在机理研究和药物筛选方面的应用，目前现有技术尚未发现有很好的只在 局部皮肤表达的Cre重组酶。而本发明基于SM22-Cre只在小鼠特殊部位的皮肤表达的最 新发现开发出能长期存活的人银屑病小鼠模型。
[0034] 本发明利用现有的已成熟的条件性基因敲除技术，培育出SM22-CreIKK2 FWF1°x小 鼠。该小鼠在头部有着与人银屑病非常相似的病灶；并且在头部病灶部位，有明显地角质形 成细胞异常的分化和增殖表皮细胞增生，颗粒层缺失，局部角化不全，真皮中有大量免疫细 胞的浸润，以及明显的毛细血管的扩张；组织学上与人银屑病极为相似。
[0035] 综上所述，本发明的人银屑病小鼠模型具有构建方法简便、经济，与人银屑病表现 高度相似等优点，并且由于本发明中小鼠银屑病样病灶的形成是自发的，不需要特别的处 理，因此，相对于已有的模型如皮肤移植或药物诱导，小鼠的使用更为方便，极具市场价值 和医药用途的前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图I :SM22-CreIKK2FWF1°x转基因小鼠与IKK2FWF1° X小鼠杂交谱系
[0037] 图2 :小鼠基因型的PCR基因定型结果
[0038] 图3 :IKK2基因在不同组织中敲除的情况
[0039] 图4 :SM22-CreIKK2FWF1°x模型小鼠表观与基因型的验证（N指正常皮肤，L指病灶 部位）
[0040] 图5 :SM22-Cre转基因小鼠在特定部位皮肤表达（A. SM22-Cre阴性R0SA2阳 性小鼠全身半乳糖苷酶染色；B. SM22-Cre阳性R0SA2阳性小鼠全身半乳糖苷酶染色； C. SM22-Cre阴性R0SA2阳性小鼠头部皮肤切片后半乳糖苷酶染色；D. SM22-Cre阳性R0SA2 阳性小鼠头部皮肤切片后半乳糖苷酶染色）
[0041] 图6:IKK2FWF1°X对照小鼠和SM22-CreIKK2 FWF1°x小鼠摄影分析(空心箭头所指为 银屑病样病灶；实心箭头所指为溃疡型病灶）
[0042] 图7:小鼠头部病灶皮肤的免疫荧光分析（K14,基底角质形成细胞标志；K10,分化 中角质形成细胞标志；Loricrin，终末期分化的角质形成细胞的标志；K6,皮肤炎症标志）
[0043] 图8:小鼠头部皮肤组织学分析
[0044] 图9 :小鼠头部皮肤组织化学分析
[0045] 图10 :代表性的各种银屑病样病变病灶
[0046] 图11 :SM22-CreIKK2FWF1°x小鼠经抗TNF处理前后，头部病灶的代表性照片（A)和 PASI 值（B)
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的保护范围。
[0048]实施例 lSM22_CreIKK2FWF1°x 小鼠的构建
[0049] 1?实验材料
[0050] SM22_Cre转基因小鼠，购自Jackson Laboratory (品系号004746);该品系小鼠的 Cre酶表达序列位于组织特异性启动子SM22的控制之下。
[0051] IKK2FWF1°X小鼠，购自Michael Karin实验室，为基因工程小鼠；该品系小鼠在 IKK2基因中插入了 Cre酶识别序列，当存在Cre酶时，细胞的IKK2基因部分片段就会被敲 除，从而使IKK2基因彻底失活。
[0052] 2.实验方法及分析
[0053] 1)实验小鼠的构建：
[0054] 通过SM22_CreIKK2FWF1°x与IKK2 FWF1°X配对来生产实验用小鼠，如图1所示，通过 两代的杂交，我们得到了 SM22-CreIKK2F1°x/F1°x小鼠，并同时得到可作为对照的同窝IKK2 F1°X/ F1°x小鼠。
[0055] 2)小鼠的基因型检测
[0056] 通过标准的PCR基因定型方法，检测小鼠的基因型。实验对象为前一步骤制备 的随机的两只野生型小鼠和随机的两只杂合子小鼠；小鼠基因组DNA通过标准程序从小 鼠尾巴分离，作为PCR扩增的模板。PCR扩增试剂为RocheAppliedScience所提供的 FastStartPCRMaster试剂盒，并按照该试剂盒提供的方法进行扩增。在每个扩增反应中， 加入了三个引物，可以扩增所有的基因型。所用引物序列如表1。
[0057] 表1引物序列
[0058]
【权利要求】
1. 一种构建人银屑病小鼠模型的方法，利用条件性基因打靶技术，其特征在于，将 IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠，与在组织特异性启动子SM22的控制下表达 Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得人银屑病小鼠模型。
2. 如权利要求1所述构建人银屑病小鼠模型的方法，其特征在于，所述人银屑病小鼠 模型的构建步骤如下： 1) 构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记 小鼠； 2) 构建Cre小鼠：构建在组织特异性启动子SM22的作用下表达Cre重组酶的Cre小 鼠； 3) 将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选，获得剔除IKK2基因的纯合子小鼠即为人银屑病 小鼠模型。
3. 如权利要求1或2任一权利要求所述构建人银屑病小鼠模型的方法，其特征在于，所 述启动子SM22含有SEQ ID NO :4所示核苷酸序列。
4. 一种人银屑病小鼠模型，由权利要求1-3任一权利要求所述方法制备获得。
5. 如权利要求4所述的人银屑病小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型体内受SM22启 动子控制的IKK2基因的表达被选择性的抑制，小鼠在头部出现人银屑病样病灶。
6. 权利要求1-3任一权利要求所述构建人银屑病小鼠模型的方法，以及权利要求4或 5任一权利要求所述人银屑病小鼠模型在制备或筛选银屑病治疗药物中的应用。
7. -种筛选银屑病治疗药物的方法，为将银屑病治疗备选药物施用于权利要求4或5 任一权利要求所述人银屑病小鼠模型的病灶部位；通过比较用药前后小鼠头部的银屑病面 积严重指数的变化，筛选出使小鼠头部的银屑病面积严重指数减小的药物做为银屑病治疗 药物。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述银屑病面积严重指数的计算方法如下： 银屑病面积严重指数=发红面积X发红严重程度+增厚面积X增厚严重程度+多鳞面 积X多鳞严重程度； 其中，发红面积为发红病灶面积占头部总面积的百分比X100 ;增厚面积为增厚病 灶面积占头部总面积的百分比X 100 ;多鳞面积为多鳞病灶面积占头部总面积的百分 比X 100 ;发红严重程度、增厚严重程度、多鳞严重程度分别根据病灶的病变严重程度对每 个类型的病灶进行打分，包括：1分为轻微，2分为严重。
【文档编号】A01K67/02GK104335970SQ201310338172
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月5日 优先权日:2013年8月5日
【发明者】应哲康, 陈敏婕 申请人:应哲康