三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因的应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体的说是一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物（PtSPH）基因的应用。三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因编码蛋白的重组表达产物可作为保鲜剂、饲料添加剂、防腐剂或蛋白酶辅助药物中制备的应用。可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。
【专利说明】三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体的说是一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源 物（PtSPH)基因的应用。
【背景技术】
[0002] 三抚梭子蟹（Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖品种，但随着养 殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌等引起的各种病害日趋 严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究，探 索免疫防治新途径，是实现其健康养殖的可靠保障。
[0003] 丝氨酸蛋白酶（Serine protease, SP)是一类重要且分布广泛的蛋白酶家族，其活 性中心包含由3个保守的氨基酸残基(组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸)组成的催化三联体结构。 丝氨酸蛋白酶同源物（Serine protease homolog，SPH)在氨基酸序列上与SP相似，但由 于一个或多个催化残基的缺失或突变(通常是丝氨酸被甘氨酸取代）导致其明显缺乏酰胺 酶活性。近年来的研究表明，SP和SPH大多是通过丝氨酸蛋白酶级联反应参与多种免疫过 程，如血液凝集、抗菌肽的合成和酚氧化酶原激活系统介导的黑化反应等。
[0004] 目前已在多个物种如果蝇、烟草天蛾、淡水螯虾、斑节对虾中鉴定出丝氨酸蛋白酶 同源物。研究认为，丝氨酸蛋白酶同源物虽失去蛋白酶的催化功能，但可作为模式识别因子 或是SP辅助因子，参与节肢动物酚氧化酶原系统的激活和抗微生物应答。例如，在烟草天 蛾中，SPH作为辅助因子协助丝氨酸蛋白酶水解酚氧化酶原；在斑节对虾中，SPH能介导细 胞黏附并具有细菌结合和抑菌活性。
[0005] 到目前为止，关于三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物的研究尚少。因此，研究三疣梭 子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因的重组表达与应用的研究，将对研究三疣梭子蟹的免疫防御 机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义，同时将有助于开发天然辅助药物用于人 类疾病的治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，三疣梭子蟹丝氨酸蛋白 酶同源物基因编码蛋白的重组表达产物可作为保鲜剂、饲料添加剂、防腐剂或蛋白酶辅助 药物的应用。
[0009] 所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因编码蛋白的重组表达产物能够 特异性的结合革兰氏阴性菌或真菌。所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌，真菌为毕赤酵母。 [0010] 所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因编码蛋白的重组表达产物，利用 带有限制性酶切位点的引物P1和P2通过PCR扩增三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因编 码区片段；再将pET30a载体与上述PCR扩增产物经BamHI和Xhol双酶切，连接后转化表 达菌株BL21 (DE3)-pLysS ;表达菌株进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经 TALON柱纯化、复性后得到具有活性的三疣梭子蟹Pt SPH编码蛋白的重组表达产物。所述 P1 为 5' GGATCCCGCCAATCTCAGTTTGGGGAGTT3' ；P2 为 5' CTCGAGTTATTTACCACCAATTCTTACATC3 〇
[0011] 本发明所具有的优点：
[0012] 本发明通过PCR技术扩增编码三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH成熟肽的基 因片段并将其克隆到PET30 (+)表达载体中，在大肠杆菌BL21 (DE3)-plysS实现体外重组表 达。重组蛋白PtSPH经TALON柱纯化和透析后，能够结合革兰氏阴性菌溶藻弧菌和真菌毕 赤酵母，当重组蛋白PtSPH浓度为50 μ Μ时，对革兰氏阴性菌溶藻弧菌和真菌毕赤酵母具有 显著的结合活性。
[0013] 本发明基因及其重组蛋白主要在蛋白酶辅助药物、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜 剂生产中应用，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭 子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实例提供的纯化的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH编码成熟 肽的基因扩增产物电泳图(其中，M :DNA marker，1 :成熟肽的基因扩增产物)。
[0015] 图2为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH重 组蛋白电泳图(其中Μ :蛋白marker ;1 :未诱导菌体中表达的蛋白；2 :IPTG诱导后表达的蛋 白；3 :纯化的重组蛋白）。
[0016] 图3为本发明实例提供的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH重组蛋白对革兰 氏阴性菌溶藻弧菌(A)和真菌毕赤酵母（B)的结合活性图(其中Μ :蛋白marker，S :上清液， W:冲洗液，E :洗脱液)。
【具体实施方式】
[0017] 下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。
[0018] 实施例1.
[0019] 三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因 Tryp_SPc催化结构域重组蛋白的获 得，具体操作如下：
[0020] 1.重组载体的构建
[0021] 根据三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH的cDNA序列，设计含有限制性内切酶 BamHI 和 Xhol 酶切位点的特异性弓丨物 P1 (5, GGATCCCGCCAATCTCAGTTTGGGGAGTT3,）和 P2 ( 5' CTCGAGTTATTTACCACCAATTCTTACATC3'），通过PCR技术扩增编码三疣梭子蟹丝氨酸蛋白 酶同源物PtSPH成熟肽的基因片段(参见图1)，反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94°C 变性 3min;94°C 变性 45s，57°C 退火50s，72°C延伸lmin30s，30个循环；最后72°C延伸10min。将扩增片段纯化与回收，与 pMD19-T简单载体连接（Takara)。转化到大肠杆菌Transl-Tl(TransGen)后筛选阳性克隆， 提取质粒。使用BamHI和Xhol两种酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片 段纯化回收；回收目的片段与经BamHI和Xhol两种酶酶切的表达载体pET30a连接，完成重 组载体的构建。
[0022] 2.重组蛋白PtSPH的表达
[0023] 将构建的重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3) -plysS，筛选阳性克隆并测序确认 表达框的正确性。挑取单克隆，接种到200ml含卡那霉素（50 μ g/ml)的LB液体培养基 中，220rmp37°C振荡培养至0.D.6(l(l=0.4-0.6。加入IPTG至终浓度为ImM诱导4小时后，在 4°C 4000rmp离心15分钟，收集菌体，与-20°C冻存备用。取lml菌液离心，弃去上清后，力口 入8(^1水和2(^1的蛋白上样缓冲液（5倍稀释)，10〇1：沸水中煮1〇1^11后离心，取上清， SDS-PAGE电泳检测表达产物。
[0024] 3.重组蛋白PtSPH的纯化与复性
[0025] 菌体在冰浴条件下用超声波180W处理20-30min (每次2s，间隔2s)，离心去掉上 清，收集沉淀(含重组蛋白包涵体)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON 柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4°C条件下，在含有2mM还原谷胱苷 肽、0. 2mM氧化谷胱苷肽、ImM EDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10%甘油和1%甘氨酸的及 梯度降低的尿素（611、4]?、31、21、1]\1、01〇的透析复性液（口!1=8.0)中透析，使重组蛋白复性， 最后在50mMTris-HCl (pH=8.0)的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后 的重组蛋白经PALL公司的Microsep Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的 BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物重组蛋白的浓度为2. 10mg/ ml (参见图2)。
[0026] 三疣梭子蟹PtSPH基因为SEQ ID No. 1中所示的碱基序列。
[0027] 序列表 SEQ ID No. 1 为：
[0028] ggggagtagt gtttgagtgt tggtggcgta aggttctgtt actgcgtggt tccctcatca ctcggttagt gtggaggagg ctcaggttta gtacaagtcc tcccgaagac caat atg tct acc tta ggg tgg aga ate ctg eta ctg gtg gtg gtg gca agg get ctg cca gat ccc tct tee teg tee tea age agg gac agg aga caa gtg gac aca tea aat ctg teg gat gca gaa tta ett tgt egg ctg aca tct gca gta gac ggt ate aat gag aat tgt gac aca cct get tee aaa cct gac aca get gtg agt ggg aac tgc agg tgt get cct gee tgg cag tgc aag gat gac act agt cct agt gag ctg act gat ggt gga age ttc ctg aca caa gtg aat gtg ege act att ggc ate tct tgt cct aca cca gag gag gtg tgc tgc ttc aac att gat gee tct eta cag ccc caa act tta ccc ttc tct cca tct tgt gga aag ege aac tct caa gga ate gta acc aat ttt gtt gga ttt gag aat ege caa tct cag ttt ggg gag ttc cct tgg atg gca get gta atg aca tee cag aeg ttt gga ccg gac gca gca cct ctg tac ate tgt ggg gga tea etc ate cac age cag ata gtg ett act get gee cat tat atg caa gat aag aca gee agt gaa eta get gta aga ett gga gag tgg aac ttc agg gaa cag tea gaa tct gtg cca cac cag gag tat gga att caa gag gtg ttg ata cac ccc aaa tac gtc ggc acc gtc ttg gca tat gat gtg gee ett etc ate ett gac cag cca gca aca ett ggc cac act gtt gac acc ate tgc ctg cca cca cca aac tat gat ttc aga gac cac aca tgt gtt gtg tct ggg tgg ggc aaa gat atg ttc agt gag act ggt aaa ttc caa caa ate ctg aag tea att gat ctg cca ccg gtg gac cac aac tee tgt gag aga gca atg aga aca aca ege ctg ggc aca age ttc aac ctg cac gag agt ttc ttg tgt get gga gga gag gee ggc aag gat gee tgc gag ggt gat ggt ggc tea ccc ttg gee tec ttt aag tet act gat cct aat aaa tac tac cag get ggt gtg gtg tet tgg ggc att ggt tec ggc caa get ggc ttg cca gga gtt tac get gat gtc age aag get gtt cca tgg att aat acc att att cag gaa aaa ttt gga cat gat gta aga att ggt ggt aaa taa aattatttct tctctctact ctaatctacc aataatcatt tcccatgcca aagtcacatc caaattagga gttttgagga ttgcaacaaa caaactttca aaataaagat CtC&CC&t&t
[0029] (a)序列特征：
[0030] ?长度：1507bp，有效长度 571-1350
[0031] ?类型：碱基序列
[0032] 籲链型：单链
[0033] #拓扑结构：线性
[0034] (b)分子类型：双链DNA
[0035] (c)假设：否
[0036] (d)反义：否
[0037] (e)最初来源：三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物
[0038] (f)特异性名称：gene
[0039] 三疣梭子蟹PtSPH基因为SEQ ID No. 2中所示的氨基酸序列
[0040] 序列表 SEQ ID No. 2 为：
[0041] MSTLGWRILLLVVVARALPDPSSSSSSRDRRQVDTSNLSDAELLCRLTSAVDGINENCDTPA SKPDTA VSGNCRCAPAWQCKDDTSPSELTDGGSFLTQVNVRTIGISCPTPEEVCCFNIDASL QPQTLPFSPSCGKRNSQGIV TNFVGFENRQSQFGEFPWMAAVMTSQTFGPDAAPLYICGGSL IHSQIVLTAAHYMQDKTASELAVRLGEffNFREQS ESVPHQEYGIQEVLIHPKYVGTVLAYDV ALLILDQPATLGHTVDTICLPPPNYDFRDHTCVVSGffGKDMFSETGKF QQILKSIDLPPVDH NSCERAMRTTRLGTSFNLHESFLCAGGEAGKDACE⑶GGSPLACFKSTDPNKYYQAGVVSWG IGCGQAGLPGVYADVSKAVPffINTIIQEKFGHDVRIGGK
[0042] (a)序列特征：
[0043] ?长度：411bp，有效长度 153-411
[0044] ?类型：碱基序列
[0045] ?链型：单链
[0046] ?拓扑结构：线性
[0047] (b)假设：否
[0048] (c)反义：否
[0049] (d)最初来源：三抚梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物
[0050] (e)特异性名称：PRT
[0051] 其具有完整的编码蛋白含有411个氨基酸，其中编码序列的1-17个氨基酸为信号 肽，成熟肽包含394个氨基酸，预测的分子量为44. 44kDa，等电点为5. 07。成熟肽具有典型 的Tryp_SPc催化结构域（259个氨基酸)，其催化结构域包含保守的催化三联体残基，其中 第三个活性位点丝氨酸（Ser)被甘氨酸（Gly)取代。
[0052] 实施例2.
[0053] 三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH重组蛋白微生物结合试验：
[0054] 1.重组蛋白及菌悬液的准备：将上述实施例重组蛋白PtSPH溶于1XPBS缓冲液 (pH=7. 4)使蛋白浓度达到2. 0mg/ml，4°C备用。在无菌条件，挑取单克隆的溶藻弧菌将其接 种到TSB (胰蛋白胨大豆肉汤3%，NaCll%)培养基中，毕赤酵母种到YPD (酵母提取物1%，胰 蛋白胨2%，葡萄糖2%)培养基中，而后于28°C和37°C振荡培养至对数生长期。离心收集菌 体，加入37%的甲醛混匀，于37°C温和震荡lh以破坏细胞的蛋白酶活性。离心收集菌体，并 用1 XPBS缓冲液（pH=7. 4)悬浮菌体，制备成细菌悬浮液（3X 108CFU/ml)，4°C备用。
[0055] 2.重组蛋白PtSPH微生物结合活性检测：在无菌的2ml离心管中分别加入 0. 5ml的菌悬液，实验组加入0. 5ml2. Omg/ml上述实施例所得重组蛋白PtSPH，阴性对照组 (blank)加入0. 5ml50mMlXPBS溶液，总体积lml，4°C温和摇动孵育40min。然后2000g4°C 离心5min，取出上清液并4°C保留备用；菌体沉淀用lXPBS(pH=7. 4)冲洗3次，冲洗液4°C 保留备用；最后菌体沉淀用1XSDS-PAGE上样缓冲液洗脱，洗脱液4°C保留备用。上清液 (S)、冲洗液（W)和洗脱液（E)分别进行15%SDS-PAGE电泳检测。
[0056] 发现上述实施例重组蛋白PtSPH能够结合革兰氏阴性菌溶藻弧菌和真菌毕赤酵 母(参见图3)，当重组蛋白PtSPH浓度为50 μ Μ时，重组蛋白PtSPH对毕赤酵母的结合活性 比对溶藻弧菌的结合活性高。
[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0001] SEQUENCE LISTING <no)中(1科学 <12CI> 一"魏棱子蟹MM醴蛋|!1_闕疆__園謙|$用 --1 ur ^ i m --- 2 ' I 70*: ff<i i.i'iil I n v?*rs ?ηπ ;1 I <210> I <2I1> 1507 m2>腦 <2：t3> :：￡Λ 梭干蟹 II* 酸 a&_BS?J .工0> ^22I> im 〈Z22' (ΒΠ ). , (vm) 、.痛)> ] ggggaguigt gtt tgaglgt tggtggcgta aggticigtt actgrgtggf tccetmtca 60 rt '^ggr t agt giggnggngg i 貧 ri ginr?mgirr f rrcgcingor rant of gt v\ I 20 aed faggot g^agnatcrt gctactggtg fi^eictcuicc nj^otccctd ISO tcdcgicct caagcaggga caggci|iiiciu:i glggacacot coaatcigtc ggotgcagoa 240 UddUgte ggct.gaciiU* tgciiKtugdi： g^UHcui.ilK amatIglK^ cacaccl^ct 300 t.cci.mucctg <ir<ic<igcist gugig^iguac igcciggigig ciccigccig· gc?igih rc<mg 360 gat.g<ic<icta glcctagl?<ι gcig<iclgal liglggfmffd led.gac<ic<i <igigy<ilglg 120 at t g grat ci cl! g t rcuicciccri g1 gel gel i c?ia ciii iga1 gee 1^0 tctciacagc cccaaaciit acccltctcl cccilcitglg gficicigcgcaa clcicaagga 51(J uiUtgiigg cgccaaiclt: agt l igg^ga κ? iced igg 600 cil^gca^i: Lg UicJtgat:<Jic LCfigcitgl 11 κ H<·^- ^ c fig cat: c U: t ^IciCciUl^t G60 tcutccacag ccagatiigtg ettaclgetg cccattatal gc?uigiiti.mg 720 h e a g e c ? g t g a a c t a g € l t aa^ac 11 gga ^aglg^aac l t eagsganea ^teagaalct 780 ^t^ccacacc aggagtataa11caa?a^ gtgtlgatac ae.cccaaula cfitcggcacc 840 gt·:: tigKcat nlgatglffgc cc I leti：a 1 c ctt ^ncv.a.gi： ragcHacrict tggr.carac: i 900
[0002] gttgacacca tctgcctgcc accaccaaac tatgatttca gagaccacac atgtgttgtg 960 tctgggtggg gcaaagatat gttcagtgag actggtaaat tccaacaaat cctgaagtca 1020 attgatctgc caccggtgga ccacaactcc tgtgagagag caatgagaac aacacgcctg 1080 ggcacaagct tcaacctgca cgagagtttc ttgtgtgctg gaggagaggc cggcaaggat 1140 gcctgcgagg gtgatggtgg ctcacccttg gcctgcttta agtctactga tcctaataaa 1200 tactaccagg ctgitgtggt gtcttgiigc attgittgcg gceaagctgg ettgecagga 1260 gtttaegetg Etgtcagcaa ggctgttcca tggattsata ccattattea ggaaaaattt 1320 ggacatgatg taagaattgg tggtaaataa aattatttct tctctctact ctaatciacc 1380 aataatcatt tcccatgcca aagtcacatc caaattagga gttttgagga ttgcaacaaa i440 ten irafnruigiii' rtrnrentnt iinnaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaiiiiuii 1500 a?iaaaa<i 1 HOT 2 ；2ii：- 4ii I^T -：220> m <222> (t5；i)". (411) -：223> ?： U)0> 2 Mel hk'r Thr Uhi i v Trp :\rg I I i.eu Jxm Ιληι VaJ Va] \ a I Λ ln Arg I 5 10 15 ?'Ua Um Asp Pr() Ser Si"' Sor Ser Ser Arg Af"）Arg ,.\rg Ghi 20 25 " 3?" ' Val ,\si> Thr Ser A<u l.cu Scr -Asp Ahi (Hu Ιλ?ι Ιληι Cvh Ar^r l.eu Tfir 35 40 45 Ser Ala Val Asp G \ v lie Asn Glu ks-n Cvs Asp Ihr Pro Ahi Ser Lvs 50 55 ' 60 。 Pr-υ Asp Ι?ιγ Ahi ':;il Ser Gly Cvs Arg C\*s Ala Pr(! Ala --.μ GIei 65 70 75 SO Cvs l.vs Asp Asp Thr Sor Pro Ghi \.vu THe- Asp Glv GIv Sor Fhe B5 90 95 l.iM： Thr (i：!i Vi-i 1 Λκιι Val Arg1.hr ! 1 c> (i I y 11 r1 Cvs Pm 'f'hr f'm 100 . 105 HO ith: (jIu Val Cvs Cvs Hh〇 S\sn 11 ts A hi Um Gl n Pro G l n Thr Π5 120 125
[0003] \,<ni Prf> Phr* Sor Pro Sor Tvs (；lv ? vs \r-4 Λκπ Sor (；!n (；iv lic^ Vaf 1：U) 135 ] IU Thr Asn Phi1 V；sl (Π v Flu1 --η Asn Xi a Si*r --η Ι?κ1 (ih iihj llu5 I I·-> 150 15Γ> HiO Pro Trp \1<? Λ!；ι 'Ua \al Thr S?t Gin Thr Pho (；iv Pro As^ \In [0，> 1V0 IV Ahs Pro I cu 『vr Π**(、;：; Gl·、. ΙΠ v St·!. Π*1 His Ser Gin ?Ιδ Val IHO IH5 WO budhr .\h! Λ!。Tvr （;| n Λ:屮 hOI"-.化 im 200 2(B V<：1 Ae^ l.m.i (i|v CUu Up Λ：'Π !1κ^ \vh t*iu (iln Srr (*!u S.t V；sl l'r0 ?!() 2!Γ> 220 Ills (hi (i I u I vs* G l v lit1 itln (ilu Sul Leu I hs Ills Pro l.v> Ivr Vid 225 2：K) 210 Γ.: v ihr \；-- leu Λ1 a ]vr Asp \；U \：a I ihj l.ini 1 f<' Lou A?：p (?· ?· Pro ' 215 250 255 Mu Thr leu G i v H i s [hr Vai Asp I hr lie (vs L*he Vvu Pro Pro Λμι 2!>0 2H5 . 270 Ivr Asf> I%/ Arg \>i? !Hs ITr Cvs Vul S^r Γ*ιν Iri> (i!v l.v.- \>p 27Γ> 2K0 2Hil \!ο? Pho Si*r iilu Tfu (ih L\n Hh^ ?'Λη Ι--π Me Lois l.vs SiT ! u* ,\s|> 21)0 295 細 Leu Pro Pro Val Asp His Asn Ser Cys Glu Arg Ala Met Arg Thr Thr 305 310 311 320 An? fi-u (ilv Ihr St*j· I'he A.sn Ijhi IHs l?]y St*j· Ι 5Ιη· l.i-u (\s ΛΙ,? GIv ' 325 ；U0 3：ii 。 iilv i：?u Alu Cil\ Ιλη Λκρ Al>s tvs Cilu Ci!s. ；\>p (mv (ilv S·1!' Pr*.? l.ru " ：iio " ：μγ> . " :m Λ?" C.Y-s Sc"- Ihr l，r〇 \s" Ivr ；i5,~> ；um -Mil Vul Se?1 Trn (ilv I h;· (]\\ Γν> Ι--ν i\\n \Ls (ilv \xm Prri (Hv Val Ivr 370 ' ' 375 ' 380 ' ' Aii-i Asff \'?-ι? Ser L\s :\Ui \a! Pr<> I id 11 ο Ληγ： Tin' ? 1 <? [ Glu Glu 385 ：Bi) 39a 400 Lvs Phe (S!v His \sfi \u! Λι ^Γ I hs Giv Giv l,v> ▼ ' 405 ?10
【权利要求】
1. 一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，其特征在于：三疣梭子蟹 丝氨酸蛋白酶同源物基因编码蛋白的重组表达产物可作为保鲜剂、饲料添加剂、防腐剂或 蛋白酶辅助药物的应用。
2. 按权利要求1所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，其特征在 于：所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因编码蛋白的重组表达产物能够特异性的结合 革兰氏阴性菌或真菌。
3. 按权利要求2所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，其特征在 于：所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌，真菌为毕赤酵母。
4. 按权利要求1所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，其特征 在于：所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因编码蛋白的重组表达产物，利用带有限制 性酶切位点的引物P1和P2通过PCR扩增三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物基因编码区片 段；再将pET30a载体与上述PCR扩增产物经BamHI和Xhol双酶切，连接后转化表达菌株 BL21 (DE3) -pLysS ;表达菌株进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经TALON 柱纯化、复性后得到具有活性的三疣梭子蟹PtSPH编码蛋白的重组表达产物。
5. 按权利要求4所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶同源物PtSPH基因的应用，其特征在 于：所述 P1 为 5' GGATCCCGCCAATCTCAGITTGGGGAGTT3' ；P2 为 5' CTCGAGTTAITTACCACCAATTCT TACATC3' 。
【文档编号】A23K1/16GK104120139SQ201310153427
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】崔朝霞, 刘媛, 宋呈文, 李倩倩 申请人:中国科学院海洋研究所