专利名称：利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法。
背景技术：
东北刺人参el la tus Nakai)又名刺参,五加科刺参属，多年生落叶灌木，是我国长白山特有的药用植物。东北刺人参分布区域十分狭窄，主要分布于吉林省长白山区，俄罗斯、朝鲜也有少量分布。近10年来，由于人为大量采挖，自然资源遭到严重破坏。目前，长白山区天然东北刺人参资源已濒临灭绝，被列为国家二类保护植物，吉林省一类保护植物。东北刺人参的根和茎中含有多种皂苷、黄酮、挥发油、蒽醌、脂肪酸、蛋白质、糖类和酚类等成分，以其干燥的根和茎作为药材，功效可用于治疗神经衰弱、低血压、糖尿病、精神忧郁等，且无任何毒副作用，在长白山区被称作“木本人参”。东北刺人参具有抗衰老作用，用刺人参醇水提取物给小白鼠灌胃，发现可延长小白鼠持续游泳的时间，耐缺氧能力提高64 %，检测10多项与衰老相关指标的结果，发现有明显的抗衰老作用。东北刺人参既可采用有性繁殖也可采用无性繁殖。但有性繁殖，因天然生长的东北刺人参结实率低，种子很少，偶尔采到的种子，发芽率很低。针对刺人参种子发芽率低的问题，刘继生等采用种子层积处理法促进东北刺人参种胚后熟，从而使发芽率提高到56.8% ;但种子繁殖的苗木经多年栽培后，因 病虫害危害往往出现死亡现象。刺人参无性繁殖包括分株、压条或扦插等方式。其中分株法是利用有匍匐茎节间不定芽可获得分生苗；压条是在刺人参生长季节，选择生长旺盛的长枝，并在节间刻伤组织后埋入土中，待小苗长出与母株分离后，成为独立植株；扦插繁殖是用茎、根或带芽的根茎作为插穗，用生长素处理后插入苗床，生根率较高，但移植成活率低。将通过无性繁殖得到的苗(扦插、压条等)进行栽种，发现栽植后有假死现象，且恢复期生长期长。另外，无性繁殖的另一问题是，因种质资源濒危的现状，繁殖材料来源短缺。东北刺人参也可通过组织培养，获得种苗，但东北刺人参试管苗的驯化条件苛刻，成活率低，难以大量提供生产用苗。为了引种野生植株，1989年柳丽等利用仿生栽培技术，对刺人参进行引种试验，结果发现刺人参带根移植成活率高，扦插苗成活率较低。此外，张顺捷等也做了引种试验，发现东北刺人参苗木在牡丹江地区引种可以成活。尽管如此，目前，东北刺人参尚未建立完善的苗木繁殖和人工栽培体系，所以在中药及临床应用上存在资源短缺的问题，导致刺人参产品及医药产业的发展受到阻碍。目前，因野生资源逐年匮乏，许多药用植物都在进行人工栽培。但大田栽培时，植物生长受气候、地理和季节的限制，且由于栽培管理中使用了农药化肥，导致有害物质的残留；同时有效物质含量不稳定、药材与农作物争地等问题也是困扰我国中药材产业发展的难题。植物组织或器官培养物中有效成分含量高且稳定，因此，以组织培养物代替其原植株作为药源，是实现野生东北刺人参资源可持续利用的有效方式之一，这对拯救野生东北刺人参资源有着极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法。具体是以东北刺人参种子诱导的不定根为材料，通过生物反应器诸理化参数的调控，进而建立不定根反应器培养体系，同时探明东北刺人参的抗氧化特性，为长白山区濒危植物东北刺人参资源的保护和开发利用提供一种新方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:
一种利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法，在5 L生物反应器中注入4 L MS培养基附加IBA 3 4 mg/L，白糖40 50 g/L，pH为5.8，注入空气75 100 mL/min，接种20 40g不定根外植体进行暗培养，培养4(T50 d后获得大量东北刺人参不定根，其中液体培养基的注入量与生物反应器的体积呈倍性增加的关系，所述的生物反应器为气升式生物反应器。本发明的气升式生物反应器是气动式反应器中的一种，其流动性均匀，提供低剪切力环境，结构简单，没有其他生物反应器(如搅拌式反应器)所具有的如泄漏点和死角多等缺点。其主要的工作原理:气体由反应器底部的流量计和过滤膜进入反应器，通过气体分布装置(喷嘴)雾状喷入反应器内培养基中，经过气液分离后在反应器上部排除，从而带动液体和培养物在反应器的循环流动，达到搅拌目的。利用气升式生物反应器对东北刺人参不定根进行培养可以提高增殖速度，在短期内获得大量的外植体。同时从成本角度考虑，生物反应器培养可减少培养基成本(琼脂使用费)，另一方面又可以减少操作人员数，从而降低劳动强度和生产成本。因此，生物反应器培养可为商业化生产提供一种新的途径，并能解决目前东北刺人参野生植株濒危及人工栽培难度大的问题，为长白山区濒危植物东北刺人参资源的保护和开发利用提供一种新方法。 下面结合附图对本发明`实施例进行详细说明。
图1为本发明生物反应器的结构示意图。
具体实施例方式如图1，利用气升式生物反应器培养东北刺人参不定根，图1中a:插头；b:气泵；c:空气流量计；d:过滤膜；e:多孔喷嘴(孔径15Mm) ； f:出气口 ；箭头表示空气流动方向。具体实施步骤如下:
(一)材料与方法
1.东北刺人参不定根生物反应器培养 ①.1BA浓度的筛选
在5 L气升式生物反应器中，注入4 L液体培养基，培养基为MS (植物组织培养常用的培养基)加入不同浓度的IBA (吲哚乙酸)(2、3、4、5和6 mg/L)，pH调节5.8，在温度121。。，压力为1.2 kg/cm2的条件下高压灭菌40 min，冷却后注入反应器中，然后在每个反应器中接入 20 g 不定根，注入 50 mL/min (air volume/culture volume/min.)的空气,在温度为25±2 °C的条件下进行暗培养，培养40 d后调查不定根的鲜物重和干物重。②.白糖浓度的筛选
依据上述试验结果，以白糖作为碳源，浓度设为30、40、50和60 g/L，其它条件同上，培养40 d后调查不定根的鲜物重和干物重。③.培养密度的筛选
依据上述试验结果，在MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L的培养基中，分别在每个反应器内接种10、20、30和40 g不定根，其它条件同上，培养40 d后调查不定根的鲜物重和干物重。④.空气注入量的筛选
依据上述试验结果，每个反应器内接种20 g不定根，暗培养，通气量设置为50、75、100和125 mL/min，其它条件同上，培养40 d后调查不定根的鲜物重和干物重。⑤.培养天数的确定
依据上述实验结果，通气量设置为75 mL/min，其他条件同上，接种后5 d开始每隔
5d停止培养一个反应器，调查不定根的鲜物重和干物重，直至第50 d。2.东北刺人参不定根的抗氧化活性
从东北刺人参反应器培养40 d的不定根和栽培2年和5年植株根和茎中提取酚及多糖，比较酚和多糖含量，并采用DPPH自由基清除活性方法分析其抗氧化活性。(二)结果与分析
1.东北刺人参不定根生物反应器培养:..IBA浓度的筛选
植物生长调节剂对不定根生长影响很大，本试验结果表明IBA浓度在31 mg/L范围内鲜物重和干物重较高，平均值分别达到332.9 g和29.7 g，其中IBA浓度为3 mg/L时鲜物重和干物重达到最大值，分别为378.3 g和34.8 g。当IBA浓度在3 4 mg/L范围之外鲜物重和干物重逐渐下降，不定根的增殖率也呈下降的趋势，在IBA浓度为3 mg/L时增殖系数最大，达到18.0。f.白糖浓度的筛选
将东北刺人参根切成约I Cm长，接种于MS附加IBA 3 mg/L的培养基中，30 d后调查结果，白糖浓度为4(T50 g/L时，不定根的增殖系数较大，平均值达到25.05，当白糖浓度为50 g/L时增殖系数最大，达到26.6，显著好于其它处理。1.培养密度的筛选
本试验结果表明反应器内接种密度为20 40 g时，不定根的鲜物重、干物重和增殖系数均较高，显著好于其他处理，平均值分别达到355.47 g、32.47 g和12.23，当接种量为20g时，不定根的鲜物重、 干物重和增殖系数最大，分别为412.4 g、40.5 g和19.6，接种量增加产量下降不利于其生长。S.空气注入量的筛选
反应器中通入空气，不仅能够维持培养基中的氧气浓度，而且对植物的生长以及代谢产物都起到作用。当通气量为75 100 mL/min时，不定根长势较好，鲜物重和干物重平均值分别达到346.7 g和35.25 g，其中通气量为75 mL/min时鲜物重和干物重达到最大，分别为368.9 g和38.1 g,均好于其他处理。当通气量为50 mL/min时,可能是由于氧气不足鲜重和干重较少，当通气量高于100 mL/min时生物量有所下降，由于气体胁迫，不定根生长和分化效果不好。⑤.培养天数的确定
将东北刺人参不定根接种在含有MS+ IBA 3 mg.L—1+白糖50 g.L—1培养基中，培养至第
5d时几乎没有太大变化，10 d左右不定根开始膨大变粗，到15 d时，不定根开始分化出细根，18 d浮于液面上，不定根颜色较白，35 d之后不定根生长缓慢，在40飞0 d时鲜物重和干物重较高，其中40 d时干重达到最大26.3 g02.东北刺人参不定根的抗氧化活性
反应器培养40 d刺人参不定根和2年生和5年生栽培刺人参根和茎中酚和多糖含量的比较，发现反应器中培养40 d的东北刺人参不定根和栽培的刺人参在总酚含量上有区别，本试验结果得出培养40 d后的不定根的总酚含量明显高于栽培刺人参根和茎中的含量，不定根中总酚达到56 mg/g DW，产量达到490.0 mg/L，栽培的刺人参根和茎中总酚含量很接近，根中略高。多糖方面，不定根中含量和2年生刺人参中的含量相接近，达到70.0 mg/gDW，产量达到 612.5 mg/L。同时，还可以看出反应器生产的不定根的多糖提取液和酚提取物对DPPH自由基有较明显的清除能力，且清除能力随着浓度的升高而增强。其中，酚提取物对DPPH消除率从26.6 %增长至94 %，而栽培2年生和5年生的无论是根还是茎的提取液在浓度为0.8mg/L时只达到了 50 %左右。在相同的浓度下，反应器中不定根的多糖和酚溶液的消除率均显著高于2年生和5年生的栽培刺人参。东北刺人参不定根具有较高的抗氧化活性，因此作为抗氧化药物的开发 ，有很高的利用价值。
权利要求
1.一种利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法，在5 L生物反应器中注入4 LMS培养基附加IBA 3 4 mg/L,白糖40 50 g/L，pH为5.8，注入空气75 100 mL/min，接种2(T40 g不定根外植体进行暗培养，培养4(T50 d后获得大量东北刺人参不定根，其中液体培养基的注入量与生物反应器的体积呈倍性增加的关系，所述的生物反应器为气升式生物反应器。`
全文摘要
本发明公开了一种利用生物反应器培养东北刺人参不定根的方法，在5L气升式生物反应器中注入4LMS培养基附加IBA3~4mg/L，白糖40~50g/L，pH为5.8，注入空气75~100mL/min，接种20~40g不定根外植体进行暗培养，培养40~50d后获得大量东北刺人参不定根。所获得的东北刺人参不定根总酚含量均高于2年生和5年生栽培刺人参根和茎中的含量；不定根中多糖含量与2年生栽培刺人参根中的含量接近；本发明可以提高增殖速度，在短期内获得大量的外植体。生物反应器培养可减少培养基成本，又降低劳动强度和生产成本，解决目前东北刺人参野生植株濒危及人工栽培难度大的问题，为商业化生产提供一种新的途径。
文档编号A01H4/00GK103141394SQ20131010190
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者廉美兰, 朴炫春, 高日, 于丹, 吴春花, 吴松权 申请人:延边大学