专利名称：壳聚糖纳米粒、防治小菜蛾的生物农药制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于农用杀虫剂技术领域，具体涉及一种生物农药制剂及其制备方法，特别一种壳聚糖纳米粒、含有双链核糖核酸的防治小菜蛾的生物农药制剂及其制备方法。
背景技术：
小菜蛾(Plutella xylostella),又名小青虫、两头尖、吊丝虫,属鳞翅目菜蛾科，是世界性迁飞害虫，其幼虫主要危害甘蓝、白菜、油菜、芥菜、萝卜等十字花科植物，给重要经济蔬菜的生产带来极大 损失。一些地区90%以上的植株损失是由小菜蛾幼虫造成，全球平均每年对其防治的费用高达10亿美元。我国各省蔬菜生产区均有为害，以南方各省发生为重。目前，对菜蛾科的防治主要包括农业防治(如轮作)、物理防治(杀虫灯等)、生物防治(BT乳剂)、化学药剂(溴氰菊酯、高效氯氰菊酯等)。农业防治和物理防治劳动力需求大、成本高、针对害虫起阶段性作用等因素，难以大规模有效推广；生物化学药剂由于其高效、易施用等优势，一直是防治菜蛾的主要手段。但由于该虫年发生世代多，一般在亚热带地区为8 — 12代，在热带地区为20代以上，世代重叠，导致用药度大，农药残留、环境污染问题严重，抗药性发展严重。已报道菜蛾对50多种杀虫剂产生了抗药性，包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类、昆虫生长调节剂及苏云金杆菌(Bt)类等杀虫剂。研究高效、绿色、环保、可持续发展农药制剂已是蔬菜生产中非常重要的研究课题。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源或者内源的双链RNA特异性地引起基因沉默的现象，目前被广泛用于鳞翅目害虫基因功能研究。如:Z.-X.Yang等用微注射的方法导入cadherin基因的dsRNA，导致该虫的死亡率和性别比率增加，并且幼虫期出现滞育现象。通过饲喂的方法，导入小菜蛾细胞色素P450(CYP6BG1)基因的dsRNA，致使该虫对除虫菊脂类农药的抗性降低。此外，通过将虫体浸泡在dsRNA溶液中引发基因沉默也是实验室常用的有效手段。RNA干扰技术在鳞翅目害虫防治方面取得的突破性进展为小菜蛾的防治奠定了理论基础，提供了一种新的小菜蛾防治策略，开辟了蔬菜保护新局面。虽然基因沉默技术开启了小菜蛾防治的新篇章，该技术手段对小菜蛾的杀灭作用已被证明，但是目前大量的尝试仅限于实验室范围，还未实现实际操作应用，基于RNAi的生物农药制剂还未见报道。限制该技术广泛应用的因素主要是:(一)没有开发出能增强dsRNA有效成分稳定性、维持其杀虫效果、适合规模化应用的成熟稳定的先进农药制剂；(二)没有探究出简单便捷、具可操作性的规模化生产工艺。先进农药制剂的标志是高效、环境友好和控释。高效取决于有效成分本身和它在剂型中的微粒尺寸，尺寸越小，表面积越大，效率就越高。水基化农药制剂如水剂、乳化剂、水乳剂、悬浮剂、悬乳剂等被认为是环境友好剂型，其农药的微粒尺寸由纳米到微米依次增大，但都不具有控释作用。为了减小农药的尺寸和实现缓释，文献报到将农药制成纳米晶粒，或者在纳米粒外部用合成高分子涂敷，或将液体农药包括成微胶囊，以及用多入口旋涡混合器将联苯菊酯制成纳米颗粒，用海藻酸钠和壳聚糖通过层层组装将吡虫啉包裹等，但这些方法烦琐，并不简单，不易进行大规模生产。
壳聚糖纳米粒作为一种新型药物载体，在医学上已成为国内外研究开发的热点。邬思辉(2009)等将壳聚糖制成纳米粒负载胰岛素，控制药物释放、延长药物疗效、降低药物毒副作用，可以提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物稳定性及改变给药途径，还可以加强制剂的祀向给药能力。刘慧(2007)等研究壳聚糖纳米粒的制备并检测其性能,希望得到一种能在黏膜给药体系应用的药物载体，从而实现抗菌药物的持续释放，达到长期疗效的目标。苏丹(2007)等以壳聚糖纳米粒为载体负载siRNA穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路，为人类疾病发生机理、疾病基因治疗靶点的鉴别以及新药研发如小分子化合物和抗体类药物的发现提供理论依据，但其研究仅适合医学而不使用于农药研究。壳聚糖纳米粒在医学上的应用已多有报道，但是在农业上的应用报道还不多见。林春梅(2009)等利用壳聚糖带阳离子的特性，使其与带阴离子的三聚磷酸钠发生离于交联，包裹部分阿维菌素颗粒后形成纳米载药颗粒。赵书言(2009)等用壳聚糖纳米粒包埋尿素，使得尿素的释放速度减慢，增强缓释效果。冯博华(2009)等以蓖麻油酸钠和壳聚糖为原料制备纳米粒子包裹鱼藤酮、印楝素植物源农药，避免了大量有机溶剂和助剂的使用。李敏(2011)等通过过氧化氢降解壳聚糖制备低聚物，以吡虫啉、毒死蜱为模型药物，研究纳米粒子的理化性质及不同制备方法形成机理。张子勇(2012)等以壳聚糖和羧甲基壳聚糖为载体，制备印楝素纳米粒子水分散液。尽管上述报道成功制备了农药壳聚糖纳米粒制剂，但是其研发均处于探究阶段，所制备的纳米粒尺寸、粒径分布、药物负载率等理化指标均不稳定，未实现标准化水平，其次工艺烦琐，不易实现规模生产，所以至今局限于实验室研究，并未见转化为产品制剂流通市场。此外，目前成功报道的农药壳聚糖制剂包埋的农药有效成分多为现存化学农药，分子量小，技术操作相对简单。本发明基于上述现状，发明出首例基于基因沉默技术的防治小菜蛾的生物农药制齐U，同时利用一种简捷、规模化的制备方法，研制出适用于有效成分dsRNA大分子的壳聚糖纳米粒助剂。本发明生物农药制剂不仅能高效防治小菜蛾，而且能体外保持dsRNA稳定性，增强其杀虫效果。本发明制剂是一种高效、环境友好和控释的先进农药制剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种适用于生物农药制剂的有效成分SiRNA的大分子的壳聚糖纳米粒。 实现上述目的的技术方案如下:一种壳聚糖纳米粒，其由以下重量百分比的原料组成:壳聚糖0.5-5%、助溶剂1_10%、防冻剂0-5%、表面活性剂0.1_1%、乳化剂
0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。优选地，壳聚糖纳米粒中的助溶剂用于增加壳聚糖的溶解性，为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。壳聚糖纳米粒中的防冻剂用于保护制剂成分免于低温造成的物理损害，优选地，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。壳聚糖纳米粒中的表面活性剂用于降低了溶液的表面张力，增强了制剂在植物或害虫体表的润湿、展布以及附着力，从而提高药效。优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。
壳聚糖纳米粒中的乳化剂用于提高胶溶、乳化、分散、交联，优选地，所述乳化剂为三聚磷酸钠、农乳400#(苄基二甲基酚聚氧乙烯醚)、农乳500#(烷基苯磺酸钙)、农乳600# (苯乙基酚聚氧乙烯醚)、农乳700# (烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物)、农乳1600# (苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)、NP系列磷酸酯(壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯)、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物。壳聚糖纳米粒中的缓冲液用于制剂酸碱调节、增加助剂溶解性。优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。壳聚糖纳米粒是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒，其粒径为100_600nmo本发明的另一个目的是提供一种防治小菜蛾的生物农药制剂，该生物农药制剂可有效控制小菜蛾，是可持续发展的绿色农药。具体方案如下:一种防治小菜蛾的生物农药制剂，其主要由以下重量百分比的成分组成:(A)0.05-15%的有效成分:针对小菜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt(优选为17_25nt)的双链核糖核酸、(B) 19.95-55%用于溶解有效成分双链核糖核酸的溶剂、(C) 30-80%上述壳聚糖纳米粒。优选地，所述小菜蛾高效致死靶基因为线粒体复合物IIIFe-S亚基基因、乙酰胆碱酯酶基因、Y-氨基丁酸受体基因、蜕皮激素基因。更优选地，针对线粒体复合物IIIFe-S亚基基因的双链核糖核酸为SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3及SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6中的一对或多对；针对蜕皮激素基因的双链核糖核酸为SEQID N0.7 及 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 中的一对或者多对；针对Y-氨基丁酸受体基因的双链核糖核酸为SEQ ID N0.13和SEQ IDN0.14、SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18 中的一对或多对；针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID N0.19及SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21及SEQID N0.22、SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27和 SEQ ID N0.28、SEQ IDN0.29 和 SEQ ID N0.30 中的一对或多对。所述有效成分双链核糖核酸核苷酸数为15_50nt、分子量为8000-40000，在其中一个实施例中，所述siRNA的3’末端设有悬挂碱基。所述溶剂用于溶解有效成分双链核糖核酸，优选地，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。本发明的另一目的是提供了一种上述防治小菜蛾的生物农药制剂的制备方法。具体技术方案如下:一种上述防治小菜蛾的生物农药制剂的制备方法，包括以下步骤:(A)溶解:称所述siRNA，(优选在800-3000r/min的转速下)溶于溶剂，(优选搅拌5-60min)，使双链核糖核酸充分溶解，得溶液；(B)壳聚糖纳米粒制备: I)准确称取壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，(优选800_3000r/min)搅拌使其充分溶解，得溶液；
2)将步骤I)所得溶液(优选以3000-10000rpm)离心(优选10_60min)，取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀，得溶液；3)将乳化剂用水溶解后(优选以10_30ml/min速度)加入步骤2)溶液中，混匀后即得壳聚糖纳米粒；(C)制剂制备:将步骤㈧中所得溶液与步骤⑶所述的壳聚糖纳米粒均匀混合，后继续搅拌即得均一稳定的双链核糖核酸生物农药制剂。按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。与现存技术相比，本发明有以下创新点:第一、本发明农药制剂的载体为壳聚糖纳米粒，是有别于现存纳米粒的可以包裹大分子的农用纳米粒。由于有效成分为双链核糖核酸，平均分子量均在8000-40000之间，分子量大，在壳聚糖纳米粒制备中需要更高的技术来符合大分子有效成分的包埋，所以本发明壳聚糖纳米粒与现存包埋小分子化学农药的纳米粒存在本质区别。第二、本发明为双链核糖核酸的壳聚糖纳米粒制剂，较以往专利中所涉双链核糖核酸与阳离子化合物的简单配伍物更有利于提高有效成分稳定性，保持更高的害虫防治效果。第三、本发明是首例基于基因沉默技术的小菜蛾生物防治剂，在世界范围内属首例剂型成熟的双链核糖核酸农药。基于其特殊杀灭害虫的机制，该制剂是一种环保、绿色、健康的生物农药制剂。第四、本发明具有一套成熟、简便、工业化操作的工艺流程，所涉生产步骤规范、标准，生产出的纳米粒生物农药制剂的理化性质等指标均为优化标准，易实现工业化大规模操作，利用该制备方法可突破实验室操作规模，实现农药纳米制剂产品的市场化。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不限于此。实施例一本实施例特别提供了以小菜蛾线粒体复合物IIIFe-S亚基基因双链核糖核酸序列为有效成分的壳聚糖纳米粒生物制剂的制备及其效果研究。(一 )针对小菜蛾线粒体复合物IIIFe-S亚基基因双链核糖核酸原药成分的设计和合成GeneBank 登录号:EU815629S1-UQCR_001:GCAAG TCCGT CACCT TCAA正义链(5，-3，):5，GCAAGUCCGU CACCU UCAA dTdT 3’ SEQ ID N0.1反义链(3，-5，):3，dTdTCGUUC AGGCA GUGGA AGUU 5，SEQ ID N0.2S1-UQCR_002:CATCC AGTGT AGTGA GCAA正义链(5，-3，):5，CAUCCAGUGU AGUGA GCAA dTdT 3’ SEQ ID N0.3反义链(3，-5，):3，dTdTGUAGG UCACA UCACU CGUU 5，SEQ ID N0.4S1-UQCR_003:CAACA ACCTC TGAGA AGTT正义链(5，-3，):5’CAACA ACCUC UGAGA AGUU dTdT 3’ SEQ ID N0.5
反义链(3，-5，):3，dTdTGUUGU UGGAG ACUCU UCAA 5，SEQ ID N0.6上述序列的3’末端设有dTdT的悬挂碱基。按照上述序列设计和合成双链核糖核酸并冷冻干燥成原药粉末。(二)0.05%双链核糖核酸生物农药制剂的制备I有效成分溶解:称取500mg上述双链核糖核酸,溶于199.5g水中，800r/min搅拌使其充分溶解；2壳聚糖纳米粒制备以聚乙二醇200做助溶剂、丙三醇做防冻剂、吐温20做表面活性剂、三聚磷酸钠做乳化剂、磷酸盐缓冲液(PH4-5)做缓冲液制备壳聚糖纳米粒。其中壳聚糖、助溶剂、防冻剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲液重量百分比为分别5 %、10 %、5 %、I %、0.5 %、60 %制备壳聚糖纳米粒，余量为水。(I)称取壳聚糖40g、聚乙二醇200 80g、丙三醇40g，溶于480g磷酸盐缓冲液(pH4-5), 800r/min转速下搅拌12h,使壳聚糖充分溶解；(2)将步骤(I)所得溶液在3000r/min下离心IOmin,取上清,加入8g吐温20,充分搅拌混合均匀；(3)称取4g三聚磷酸钠溶于156g水中，充分搅拌，然后与步骤⑵所得溶液混合均勻，即得壳聚糖纳米粒，粒径100_600nm。按照上述方法制备的壳聚糖纳米粒及生物农药制剂的粒径分布、药物负载率等理化指标均比较稳定，可进行标准化水平生产。3制剂制备:将步骤I中有效成分溶液与步骤2所得壳聚糖纳米粒溶液均匀混合，即得。(三)0.05%双链核糖核酸生物农药制剂的防治效果将0.05%生物农药制剂稀释至100mg/L，均匀喷施在接有小菜蛾幼虫的甘蓝盆栽上，每盆喷施5ml，每处理重复三次，72h后统计小菜蛾幼虫出现蜕皮未尽症状虫数或着死亡数。结果如下表所示。表针对小菜蛾线粒体复合物IIIFe-S亚基基因设计合成的双链核糖核酸为有效成分的生物制剂对小菜蛾的防治效果
权利要求
1.一种壳聚糖纳米粒，其特征是，其由以下重量百分比的原料组成: 壳聚糖0.5-5 %、助溶剂1-10 %、防冻剂0-5 %、表面活性剂0.1-1 %、乳化剂0.1-0.5%、缓冲液40-60%、余量为水。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述助溶剂为聚乙二醇200、聚乙二醇400、乙醇、丙二醇中的一种或者几种混合物。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述防冻剂为丙三醇、乙二醇、异丙醇、二甘醇中的一种或者几种混合物。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或者几种混合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的壳聚糖纳米粒，其特征是，所述乳化剂为三聚磷酸钠、苄基二甲基酚聚氧 乙烯醚、烷基苯磺酸钙、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩聚物、苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚磷酸酯、苯乙基聚氧乙烯醚硫酸铵盐、烷基联苯醚二磺酸镁盐中的一种或者几种混合物；所述缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液的一种或者几种混合物。
6.一种防治小菜蛾的生物农药制剂，其特征是，其主要由以下重量百分比的成分组成: (A)0.05-15%的有效成分:针对小菜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为17-50nt的双链核糖核酸、(B)19.95-55%溶剂、 (C)30-80%权利要求1-5任一项所述的壳聚糖纳米粒。
7.根据权利要求6所述的防治小菜蛾的生物农药制剂，其特征是，所述小菜蛾高效致死靶基因为线粒体复合物IIIFe-S亚基基因、乙酰胆碱酯酶基因、Y-氨基丁酸受体基因、脱皮激素基因。
8.根据权利要求7所述的防治小菜蛾的生物农药制剂，其特征是，针对线粒体复合物IIIFe-S亚基基因的双链核糖核酸为SEQ ID N0.1及SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3及SEQID N0.4,SEQID N0.5和SEQ ID N0.6中的一对或多对；针对蜕皮激素基因的双链核糖核酸为 SEQ ID N0.7 及 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11 及 SEQ IDN0.12中的一对或者多对；针对Y-氨基丁酸受体基因的双链核糖核酸为SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14,SEQID N0.15 和 SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18 中的一对或多对；针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID N0.19及SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21及 SEQ ID N0.22、SEQ IDN0.23 和 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ IDN0.27 和 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30 中的一对或多对。
9.根据权利要求6-8任一项所述的防治小菜蛾的生物农药制剂，其特征是，所述溶剂为甲醇、二甲亚砜、水、Tris缓冲液中一种或者几种混合物。
10.一种权利要求6-9任一项所述的防治小菜蛾的生物农药制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤: (A)溶解:称取所述siRNA，溶于溶剂，搅拌，使所述siRNA充分溶解，得溶液； (B)壳聚糖纳米粒制备: I)称取所述壳聚糖、助溶剂和防冻剂，加入到缓冲液中，搅拌使其充分溶解，得溶液I ;2)将溶液I离心，取上清，加入表面活性剂，充分搅拌，混匀，得溶液2； 3)将乳化剂用水溶解后加入溶液2中，混匀后即得壳聚糖纳米粒； (C)制剂制备:将步骤(A)中所得溶液与步骤(B)所得的壳聚糖纳米粒混合均匀，即得所述防治小菜蛾的生物农 药制剂。
全文摘要
本发明公开了一种由以下重量百分比的原料组成的壳聚糖纳米粒壳聚糖0.5-5％、助溶剂1-10％、防冻剂0-5％、表面活性剂0.1-1％、乳化剂0.1-0.5％、缓冲液40-60％、余量为水。还提供了一种防治小菜蛾的生物农药制剂及其制备方法，其主要由以下重量百分比的成分组成(A)0.05-15％的有效成分针对小菜蛾高效致死靶基因设计合成siRNA，所述siRNA为15-50nt的双链RNA、(B)19.95-55％溶剂、(C)30-80％所述的壳聚糖纳米粒。所述壳聚糖纳米粒使生物农药制剂的稳定性、防治小菜蛾效果更好。
文档编号A01N43/90GK103109800SQ20131006094
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者张必良 申请人:广州市锐博生物科技有限公司