新颖的抗真菌组合物的利记博彩app

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【专利摘要】本发明涉及新颖的抗真菌组合物，及其在处理农产品中的用途。
【专利说明】新颖的抗真菌组合物
【技术领域】
[0001]本发明公开了控制植物疾病和预防作物微生物腐败(spoilage)的新颖的抗真菌组合物。
[0002]发明背景
[0003]据估计世界作物产量的约25%由于微生物腐败而损失，其中真菌导致的腐败是迄今为止最严重的原因。从经济学观点以及人道主义观点(humane point)来看，预防食品腐败都非常重要。毕竟世界上许多地方的人在遭受饥饿。
[0004]在抵抗植物和作物疾病以及减轻它们对产量和品质造成的损伤方面的成功大幅取决于杀真菌剂的及时应用。由于抗性现象的发生，许多杀真菌剂(例如苯并咪唑)的长期和频繁使用促成了它们有效性的降低。
[0005]一类重要的杀真菌剂是吡唑(pyrazole)。吡唑杀真菌剂吸引了许多工业公司的注意力。这导致例如以下杀真菌剂的商业应用:用于控制水稻纹枯病(rice sheat blight)的氟吡菌胺(furametpyr),和具有抵抗灰霉、白粉病、苹果黑星病(apple scab)、锈病(rusts) >Rhizoctonia 和 Botrytis 的活性的吡噻菌胺(penthiopyrad)(见例如 Vicentiniet al.2007) 0在WO 2010/091803中公开了琥珀酸脱氢酶抑制剂如吡噻菌胺、氟吡菌酰胺(fluopyram)、联苯吡菌胺(bixafen)和吡唑萘菌胺(isopyrazam)用于延长水果和蔬菜的货架期和储存稳定性的用途。尽管目前它们对吡唑杀真菌剂具有敏感性，但是存在很高的下述风险:许多真菌会随时间获得抵抗这些杀真菌剂的抗性。
[0006]几十年来,多烯大环内酯抗霉菌剂那他霉素(natamycin)已被用于预防食品如乳酪和香肠上的真菌生长。通过使用Streptomyces natalensis发酵生产的这一天然防腐剂在全世界被广泛用作食物防腐剂，并且在食品工业中具有安全使用的悠久历史。在US5，597，598中公开了包含多烯抗真菌化合物、酸性抗真菌化合物和额外的有机酸或其碱金属盐或碱土金属盐用于处理食品和农产品的用途。那他霉素针对所有已知的食物腐败真菌都非常有效。尽管那他霉素在例如乳酪工业中被应用多年，但是迄今为止从未观察到抗性真菌物种的发生。
[0007]因此可以得出结论:对更有效的、更加环境友好的、低毒性和有害性较低的用于处理植物和作物中的真菌生长和植物和作物上的真菌生长的抗微生物组合物(例如抗真菌组合物)具有严重的需求。

【发明内容】

[0008]本发明通过提供含有多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的新的协同抗微生物(例如抗真菌)组合物，解决了上述问题。在本文中使用时，术语“协同的”表示组合使用时抗真菌化合物的组合效果大于他们各自使用时的效果之和。
[0009]通常，两种活性成分的协同活性可以例如使用处理交互作用层(treatmentinteraction stratum,见SI inker, 1998)在方差分析模型中测试。相对有效性可以通过下式计算:((未经处理的对照的进化状态值-组合物的进化状态值)/ (未经处理的对照的进化状态值))X 100。然后可以通过下式计算交互作用系数:((化合物A+化合物B的组合的相对有效性)/ (化合物A的相对有效性+化合物B的相对有效性))X 100。大于100的交互作用系数表示化合物之间的协同作用。
[0010] 或者可以如下计算协同作用:可以通过计算与用对照组合物处理的产品上的霉菌生长相比，用活性成分处理的产品上观察到的霉菌生长的减少，来测定个体活性成分的抗真菌活性(以％计)。可以根据Colby方程(Colby，1967)计算包含两种活性成分的组合抗真菌组合物的预期抗真菌活性(E，以％计):E = Χ+Υ_[ (X.Y)/100]，其中X和Y分别是个体活性成分X和Y的观察到的抗真菌活性(以％计)。如果组合的观察到的抗真菌活性(0，以％计)超出组合的预期抗真菌活性(Ε，以％计)并且因而协同因子0/Ε> 1.0，那么活性成分的组合应用导致协同的抗真菌效应。
[0011 ] 在本发明的一个实施方式中，至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物选自由联苯吡菌胺(bixafen)、胺苯吡菌酮(fenpyrazamine)、氟唑菌酰胺(fIuxapyroxad)、氟批菌胺(furametpyr)、批唑萘菌胺(isopyrazam)、氟唑菌苯胺(penf Iufen)、批噻菌胺(penthiopyrad)、批咪唑(rabenzazole)和环苯批菌胺(sedaxane)组成的组。在一个实施方式中，组合物可还含有两种或更多不同的来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物。应当理解，来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的盐或溶剂合物)或来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的经修饰的形式也可以应用在本发明的组合物中。含有吡唑杀真菌剂例如联苯吡菌胺的商业产品的例子是具有以下商品名的产品:Aviator⑧235 Xpro?和Siltra? Xpro?。所述商业产品可以被并入本发明中 。
[0012]在一个实施方式中，多烯抗真菌化合物选自由以下化合物组成的组:那他霉素、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B、三烯菌素(trienin)、意北霉素(etruscomycin)、菲律宾菌素(filipin)、钦氏菌素(chainin)、制皮菌素(dermostatin)、lymphosarcin、杀念珠菌素(candicidin)、金色制霉素(aureofungin) A、金色制霉素B、哈霉素(hamycin)A、哈霉素B和鲁斯霉素(Iucensomycin)。在一个优选的实施方案中，多烯抗真菌化合物是那他霉素。在一个实施方案中，组合物也可含有两种或更多种不同的多烯抗真菌化合物。应当理解，多烯抗真菌化合物的衍生物(包括但不限于多烯抗真菌化合物的盐或溶剂合物)或经修饰形式的多烯抗真菌化合物也可以在本发明的组合物中应用。含有那他霉素的商业产品的一个例子是商品名为Delvocid ?的产品。所述产品由DSM Food Specialties (荷兰)生产，并且可以是含有例如50% (w/w)那他霉素的固体或是含有例如2-50% (w/v)那他霉素的液体。所述商业产品可以被并入本发明的组合物中。
[0013]本发明的组合物通常包含从约0.005g/l到约100g/l和优选地从约0.01g/Ι到约50g/l的多烯抗真菌化合物。优选地，所述量为0.01g/Ι到3g/l。
[0014]本发明的组合物通常包含从约0.0001g/l到约2000g/l和优选地从约0.0005g/l到约1500g/l的来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物。更优选地，所述量为从0.001g/l到 1000g/l。
[0015]在一个实施方式中，本发明的组合物还包含至少一种选自下组的额外化合物，所述组由粘着剂(sticking agent)、载剂、着色剂、保护性胶体、粘合剂(adhesive)、除草剂、肥料、增稠剂、掩蔽剂、触变剂、表面活性剂、其他抗微生物化合物、洗涤剂、防腐剂、铺展剂、填充剂、喷雾油、流动添加剂、矿物质、溶剂、分散剂、乳化剂、湿润剂、稳定剂、消泡剂、缓冲剂、UV-吸收剂和抗氧化剂组成。其他抗微生物抗真菌化合物可以是抗真菌化合物(例如抑霉唑、噻苯达唑或百菌清)，或抵抗昆虫、线虫、螨虫和/或细菌的化合物。当然，根据本发明的组合物也可以包含两种或更多种任何上述额外的化合物。在两种防抗真菌化合物被分别应用的情况下，任何上述额外的化合物也可以与多烯抗真菌化合物和/或至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物组合。在一个实施方式中，额外的化合物是特定用途(例如食物、饲料、药物、化妆品或农业)可接受的添加剂。适用于食物、饲料、药物、化妆品或农业的额外的化合物是本领域技术人员已知的。
[0016]在一个特定的实施方式中，其他抗微生物化合物是属于亚磷酸盐类的天然作物保护化合物，例如KH2PO3或K2HPO3或这两种亚磷酸盐的混合物。在本文中使用时，含亚磷酸根的化合物表示包含亚磷酸根即PO3 (以例如H2PO3' HPO32-或PO33-的形式)的化合物，或允许释放亚磷酸根离子的任何化合物，包括化合物例如亚磷酸和膦酸及其衍生物如酯和/或碱金属盐或碱土金属盐。在本发明的组合物包含多烯抗真菌化合物(例如那他霉素)和至少一种含亚磷酸根的化合物的情况下，相对于每克多烯抗真菌化合物，它们优选地包含0.1g或更少的木素磺酸盐(Iignosulphonate),更优选地0.1g或更少的多酹。优选地，相对于每克多烯抗真菌化合物，它们包含0.01g或更少的木素磺酸盐，更优选地0.01g或更少的多酚。具体地，它们不含木素磺酸盐，并优选地不含多酚。含亚磷酸根的化合物的合适例子是亚磷酸及其(碱金属或碱土金属)盐，例如亚磷酸钾盐例如KH2PO3和K2HPO3,亚磷酸钠盐和亚磷酸铵盐，和亚磷酸的(C1-C4)烷基酯及其盐，例如乙基亚磷酸铝(乙膦铝(fosetyl-Al))、乙基亚磷酸钙、异丙基亚磷酸镁、异丁基亚磷酸镁、仲丁基亚磷酸镁和正丁基亚磷酸铝。当然，含亚磷酸根的化合物的混合物也包括在内。例如KH2POjP K2HPO3的混合物可以通过例如向KH2PO3溶液中添加KOH或K2CO3至5.0-6.0的终pH来容易地获得。如上文所指出的，作物或植物中被代谢成为亚磷酸盐/酯化合物的前体-型化合物也可以包括在本发明的组合物中。其例子是膦酸酯，例如乙膦铝复合物。在例如作物或植物中，该分子的膦酸乙基酯部分被 代谢成为亚磷酸盐/酯。这类化合物的一个例子是被称作Aliette ?(Bayer,德国)的商业膦酸氢乙基酯(ethyl hydrogen phosphonate)。组合物中亚磷酸盐/酯与那他霉素的比例(以重量计)一般在2: I到500: l(w/w)之间，优选地在3: I到300: I (w/w)之间，更优选地在5: I到200: l(w/w)之间。
[0017]根据本发明的组合物可具有从I到10、优选地从2到9、更优选地从3到8、最优选地从4到7的pH。它们可以是固体例如粉末组合物，或者可以是液体。本发明的组合物可以是水性或非水性的即用型组合物，但是也可以是水性或非水性的浓缩组合物/悬浮液，或在使用前必须用合适的稀释剂例如水或缓冲体系稀释的储存组合物、悬浮液和/或溶液。或者，本发明的组合物也可以被用于制备涂层乳液。本发明的组合物也可以具有浓缩干产品(例如粉末、颗粒和片剂)的形式。它们可以被用于制备用于对产品进行浸没或喷雾的组合物，所述产品例如是农产品，包括植物、作物、蔬菜和/或水果。当然，当多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物作为独立的组合物被施用时，以上也适用。
[0018]在另一个方面中，本发明涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的试剂盒。多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物可存在于两个独立的包装(例如容器)中。试剂盒的组分可以是包装中的干燥形式或是液体形式。需要时，试剂盒可包含用于溶解化合物的说明书。另外，试剂盒可含有用于应用化合物的说明书。
[0019]在另一方面，本发明涉及通过用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物处理农产品来保护产品抵抗真菌的方法。另外，可以在用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物处理产品之前、同时或之后，用其他抗真菌和/或抗微生物化合物处理产品。可以通过多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的顺次应用来处理产品，或反之亦然。或者，可以通过多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的同时应用来处理产品。在同时应用的情况下，化合物可存在于被同时应用的不同的组合物中，或化合物可存在于单一组合物中。还在另一实施方式中，可以通过应用两种抗真菌化合物的单独模式或交替模式来处理产品。在一个实施方式中，本发明涉及通过对产品应用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物来处理产品的方法。通过应用化合物，能够预防产品上或产品中的真菌生长。也就是说，化合物保护产品抵抗真菌生长和/或抵抗真菌感染和/或抵抗真菌腐败。化合物也可以被用于处理已经感染真菌的产品。通过应用化合物，归因于这些产品上或产品中真菌的疾病发生可以被减缓、停止，或产品甚至可以从疾病中痊愈。在本发明的一个实施方式中，用根据本发明的组合物或试剂盒处理产品。在一个实施方式中，产品是食物、饲料、药物、化妆品或农产品。在一个优选的实施方式中，产品是农广品。
[0020] 多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物、根据本发明的组合物和根据本发明的试剂盒可以通过喷雾被应用至产品。适用于将液体形式的这些化合物、组合物和试剂盒应用至产品的其他方法也是本发明的一部分。这些方法包括但不限于，浸溃(dipping)、烧水、浸透(drenching)、引入接收器(dump tank)中、蒸发、雾化(atomizing)、成雾(fogging)、熏蒸、涂抹、刷抹(brushing)、粉化(dusting)、起泡、铺展、包装和涂覆(例如借助于蜡或静电)。另外，也可以将抗真菌化合物注射进土壤中。使用自动化系统的喷雾应用已知降低人力成本并且是成本有效的。为此目的可使用本领域技术人员公知的方法和设备。感染风险较高时，根据本发明的组合物也可以定期喷雾。感染风险较低时，喷雾间隔可以更长。取决于应用的类型，应用的多烯抗真菌化合物的用量可以从5ppm到10，OOOppm、优选地从IOppm到5，OOOppm和最优选地从20到1，OOOppm变化。取决于应用类型，被应用的至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的用量可从IOppm到5，OOOppm、优选地从20ppm到3，OOOppm和最优选地从50到1，OOOppm变化。
[0021]在一个特定的实施方式中，可以在收获后处理农产品。通过使用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物，在较长的时间段中实现了收获后和/或储存疾病的控制，从而允许在长距离和在温度与湿度方面具有不同的受控气氛的多种储存条件下运输收获的农产品。收获后储存病症为例如皮孔斑点(lenticel spots)、枯萎(scorch)、衰老性分解(senescent breakdown)、苦陷症(bitter pit)、褐斑(scald)、水核(water core)、褐化(browning)、维管分解(vascular breakdown)、CO2 损伤、CO2 或 O2不足、和软化。真菌疾病可例如由以下真菌引起:Mycosphaerella spp.、Mycosphaerellamusae、Mycosphaerella fragariae、Mycosphaerella citri ;毛霉属的物种(Mucor spp.)，例如 Mucor piriformis ；Monilinia spp.，例如 Monilinia fructigena、Monilinia Iaxa ；拟莖点霉属的物种(Phomopsis spp.)、Phomopsis natalensis ；Colletotrichum spp.，例如 Colletotrichum musae、 Colletotrichum gloeosporioides、 Colletotrichumcoccodes ；Verticillium spp.， 例如 Verticillium theobromae ；Nigrospora spp.；Botrytis spp.，例如 Botrytis cinerea ；Diplodia spp.，例如 Diplodia citri ；Pezicula spp.；Alternaria spp.，例如 Alternaria citr1、Alternaria alternata ；Septoria spp.，例如 Septoria depressa ；Venturia spp.，例如 Venturia inaequalis、Venturia pyrina ；Rhizopus spp.， 例如 Rhizopus stolonifer、Rhizopus oryzae ；Glomerella spp.，例如 Glomerella cingulata ；Sclerotinia spp.，例如 Sclerotiniafruiticola ；Ceratocystis spp.，例如 Ceratocystis paradoxa ；Fusarium spp.，例如Fusarium semitectum、Fusarium moniliforme、Fusarium solan1、Fusarium oxysporum ；Cladosporium spp.， 例如 Cladosporium fulvum、 Cladosporium cladosporioides、Cladosporium cucumerinum、Cladosporium musae ;青霉菌属的物种(Penicillium spp.)，例如绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、扩展青霉菌(Penicillium expansum)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、意大利青霉菌(Penicillium italicum)；Phytophthora spp.， 例如 Phytophthora citrophthora、Phytophthora fragariae、Phytophthora cactorum、Phytophthora parasitica ；Phacydiopycnis spp.， 例如Phacydiopycnis malirum ；Gloeosporium spp.，例如 Gloeosporium album、Gloeosporiumperennans、Gloeosporium fructigenum、Gloeosporium singulata ；Geotrichum spp.，例如Geotrichum candi dum ；Phlyctaena spp.，例如Phlyctaena vagabunda ；Cylindrocarponspp.，例如 Cylindrocarpon mali ；Stemphyllium spp.，例如 Stemphyllium vesicarium ；Thielaviopsis spp.，例如 Thielaviopsis paradoxy ；曲霉属的物种(Aspergillusspp.)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、Aspergillus carbonarius ；Nectria spp.，例如 Nectria galligena ；Cercospora spp.，例如 Cercospora angrec1、Cercospora api1、Cercospora atrofiliformis、Cercospora musae、Cercospora zeae—maydis。
[0022]本发明的另一方面涉及多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物保护产品抵抗真菌的用途。如上文所述，化合物可以顺次或同时使用(例如应用)。在一个实施方式中，本发明涉及一种用途，其中根据本发明的组合物或试剂盒被应用至产品。在一个实施方式中，产品是食物、饲料、药物、化妆品或农产品。在一个优选的实施方式中，产品是农产品。
[0023]在一个特定的实施方式中，多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物可在药物中被用于例如治疗和/或预防真菌疾病。多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物可例如以药物组合物的形式被使用。组合物可还包含药物可接受的赋形剂。抗真菌化合物可口服施用或肠胃外施用。组合物的类型取决于施用途径。
[0024]本发明的另一个方面涉及用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物处理的产品。在一个实施方式中，用根据本发明的组合物或试剂盒处理产品。本发明因此涉及包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的产品。经处理的产品的表面上和/或产品内可包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物。或者，经处理的产品可包含涂层，所述涂层包含这些化合物。在一个实施方式中，经处理的产品表面上包含从0.0OOOOl到200mg/dm2、优选地
0.00001到100mg/dm2、更优选地从0.00005到10mg/dm2的多烯抗真菌化合物。在另一个实施方式中，它们在表面上包含从0.000001到200mg/dm2、优选地0.00001到100mg/dm2、更优选地从0.00005到10mg/dm2的至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物。在一个实施方式中，产品是食物、饲料、药物、化妆品或农产品。在一个优选的实施方式中，产品是农产品。
[0025]在本文中使用时，术语“食品“应当被非常广义地理解，包括但不限于，乳酪、奶油乳酪、碎乳酪、松软干酪(cottage cheese)、经加工的乳酪、酸奶油、干燥的经发酵的肉制品，包括萨拉米香肠和其他香肠、葡萄酒、啤酒、酸乳、果汁和其他饮料、沙拉酱、松软干酪酱(cottage cheese dressing)、蘸料、烘焙制品和烘焙填料、表面釉(surface glaze)和糖霜、涂抹酱、披萨饼馅料、糕饼和糕饼填料、橄榄、橄榄卤水(olive brine)、橄榄油、果汁、番茄泥和番茄糊、作料、和水果浆和其他类似的食品。
[0026]在本文中使用时，术语“饲料产品”也应当非常广义地理解，包括但不限于宠物食物、肉鸡饲料等等。
[0027]在本文中使用时，术语“药物产品”也应当非常广义地理解，包括包含活性分子例如药物、药剂或药物化合物和任选地包含药物可接受的赋形剂的产品，所述赋形剂即与活性分子组合用于制备合适或便利的剂型的任何惰性物质。
[0028]在本文中使用时，术语“化妆品产品”也应当非常广义地理解，包括下述产品，所述产品被用于通过防止水分的蒸腾来保护或治疗角质组织如皮肤和唇、头发和指甲的干燥，并且护理组织以及给予这些组织良好的外观。术语“化妆品组合物”涉及的产品包括但不限于保湿霜、个人清洁产 品、闭合的药物递送贴片、指甲油、粉、擦拭片、护发素、皮肤处理乳液、剃须霜等等。
[0029]在本文中使用时，术语“农产品”也应当非常广义地理解，包括但不限于谷物，例如小麦、大麦、裸麦、燕麦、水稻、高粱等等；甜菜，例如糖用甜菜(sugar beet)和饲料甜菜(fodder beet);梨果和核果和浆果，例如苹果、梨、李子、杏、桃、杏仁、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓；豆科植物，例如豆子、扁豆、豌豆、大豆；油料植物，例如油菜、芥末、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻植物、可可、花生；葫芦科，例如南瓜、小黄瓜(gherkins)、甜瓜、黄瓜、倭瓜、爺子；纤维植物，例如棉花、亚麻、大麻、黄麻；柑橘水果，例如橙、柠檬、葡萄柚、蜜桔、枸橼；热带水果，例如木瓜、百香果、芒果、杨桃、菠萝、香蕉、奇异果；蔬菜，例如菠菜、莴苣、芦笋、十字花科如卷心菜和芜菁、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、马铃薯种子(seed-potatoe)、尖辣椒(hot pepper)和甜椒；月桂样植物,例如酪梨、肉桂、樟脑树；或产品如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、葡萄藤、酒花、橡胶植物、以及观赏植物例如切花、玫瑰、郁金香、百合、水仙花、藏红花、风信子、大丽花、大丁草、康乃馨、倒挂金钟(fuchsias)、菊花和球根花丼(flower bulbs)、灌木、落叶树和常绿树例如松柏植物、温室植物和树木。其包括但不限于植物及其部分、果实、种子、插条(cuttings)、栽培种、移植物、鳞茎、块茎、根-块茎、根茎、切花和蔬菜。
[0030]用于制备本文所述的组合物的方法是本发明的另一个方面。方法包括向至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物添加多烯抗真菌化合物。化合物可例如被单独地添加至水性组合物并混合，需要时随后调节pH、粘度等等。如果单独添加，则单独的化合物中的一些或全部可以是粉末形式，但是替代性地，一些或全部也可以是液体形式。化合物也可例如以粉末形式被彼此添加并混合，以获得粉末组合物。粉末状的组合物可随后被添加至水性组合物。
实施例
[0031]实施例1
[0032]收获前应用
[0033]用真菌接种香蕉植物的叶。未经接种的叶被包括在内作为对照。接着，用组合物I (那他霉素)、组合物2 (联苯吡菌胺)、组合物3 (胺苯吡菌酮)、组合物4 (氟唑菌酰胺)、组合物5 (氟吡菌胺)、组合物6 (吡唑萘菌胺)、组合物7 (氟唑菌苯胺)、组合物8 (吡噻菌胺)、组合物9 (吡咪唑)、组合物10 (环苯吡菌胺)、组合物11 (那他霉素+联苯吡菌胺)、组合物12 (那他霉素+胺苯吡菌酮)、组合物13 (那他霉素+氟唑菌酰胺)、组合物14 (那他霉素+氟吡菌胺)、组合物15 (那他霉素+吡唑萘菌胺)、组合物16 (那他霉素+氟唑菌苯胺)、组合物17 (那他霉素+吡噻菌胺)、组合物18 (那他霉素+吡咪唑)或组合物19 (那他霉素+环苯吡菌胺)处理叶的确定部分。通过喷雾应用每种组合物。未经处理的叶也包括在内(未经处理的对照)。
[0034]获得的结果显示本发明的组合物保护香蕉植物免于真菌生长，还证明与活性化合物各自应用时的活性相比，本发明的组合物显示协同增强的活性。
[0035]实施例2
[0036]收获后应用
[0037]根据de Lapeyre de Bellaire and Dubois (1987)所述方法使香蕉受伤。使用木塞穿孔器对香蕉造成创伤，之后用真菌孢子污染。在室温下孵育若干小时后，将香蕉浸在以下组合物之一中:a)无处理(对照I)、b)浸在水中(对照2)、c)浸在那他霉素中、d)浸在联苯吡菌胺中、e)浸在胺苯吡菌酮中、f)浸在氟唑菌酰胺中、g)浸在氟吡菌胺中、h)浸在吡唑萘菌胺中、i)浸在氟唑菌苯胺中、j)浸在吡噻菌胺中、k)浸在吡咪唑中、I)浸在环苯吡菌胺中、m)浸在那他霉素+联苯吡菌胺中、η)浸在那他霉素+胺苯吡菌酮中、ο)浸在那他霉素+氟唑菌酰胺中、P)浸在那他霉素+氟吡菌胺中、q)浸在那他霉素+吡唑萘菌胺中、r)浸在那他霉素+氟唑菌苯胺中、s)浸在那他霉素+吡噻菌胺中、t)浸在那他霉素+吡咪唑中、u)浸在那他霉素+环苯吡菌胺中。在该处理后，将香蕉在闭合箱中于21°C和提高的湿度下孵育。每天视觉评价香蕉的真菌发展。
[0038]结果显示与单独的那他霉素或至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物相比，含有那他霉素和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的组合物更好地保护香蕉抵抗真菌。令人惊讶的是，那他霉素和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的组合应用导致感染的强烈的协同减少。
[0039]实施例3
[0040]处理草莓
[0041]每个处理组使用十个新鲜的、有机的草莓。用0.5mm长的切口对每个草莓造成创伤，用10 μ I含有I X IO5孢子/ml的Botrytis cinerea悬浮液接种每个创口。在20°C下孵育2小时后，在新鲜制备的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷兰)、2000ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个草莓各自浸溃I分钟。抗真菌组合物还包含3.1% (w/w)蜂蜡、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯(Tween 60) >0.03% (w/w)甲基轻乙基纤维素(MHEC) >0.02% (w/w)黄原胶、
0.02% (w/w)消泡剂、0.15% (w/w)柠檬酸和0.01% (w/w)山梨酸钾。组合物的pH为4。使用不含那他霉素和联苯吡菌胺的组合物作为对照。将经处理的草莓在闭合箱中于暗中和20 °C下孵育。
[0042]在孵育期间，以双重方式评价草莓上的霉菌生长:(i)计数每10个草莓总数中长有霉菌的草莓数量；和(ii)通过计算与用对照组合物处理的草莓上的霉菌生长相比，用抗真菌组合物处理的草莓上观察到的霉菌生长的减少，来测定个体和组合的活性成分的抗真菌活性(以％计)。根据Colby方程(Colby, 1967)计算包含两种活性成分的组合抗真菌组合物的预期抗真菌活性(E，以％计):[0043]E = X+Y-[(X.Y)/100]
[0044]其中X和Y分别是个体活性成分X和Y的观察到的抗真菌活性(以％计)。如果组合的观察到的抗真菌活性(0，以％计)超出组合的预期抗真菌活性(Ε，以％计)并且因而协同因子0/Ε > 1.0，那么活性成分的组合应用导致协同的抗真菌效应。
[0045]表1 (每10个草莓总数中长有霉菌的草莓数)和表2 (抗真菌活性)中的结果清楚地证实，与单独的那他霉素或联苯吡菌胺相比，包含500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺的抗真菌组合物在草莓上具有强得多的抗真菌活性。
[0046]孵育3到6天期间，用对照组合物或那他霉素任一单独处理的所有10个草莓均显示霉菌生长。使用联苯吡菌胺处理时，第3天和第4天10个草莓中分别有8个和9个长有霉菌。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物处理的草莓中，第3天仅4个草莓观察到霉菌生长，第4天仅5个草莓观察到霉菌生长，第5天和第6天仅8个草莓观察到霉菌生长(见表1)。另外，孵育3天和9天之间，对包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物观察的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出15%到27%。相应的协同因子从第3天的
1.2提高至第9天的6.0 (见表2)。
[0047]因此，500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺的组合应用在草莓上具有非常强的协同抗真菌效应。
[0048]实施例4
[0049]处理草莓
[0050]如实施例3中所述进行实验，不同之处在于首先对每个草莓造成创口，然后在20°C下孵育2小时，再在新鲜制备的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷兰)、1000ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个草莓各自浸溃I分钟。处理后，用10 μ I含有I X IO5孢子/ml的Botrytis cinerea悬浮液接种每个草莓。根据实施例3中所述的两种方法针对霉菌生长评价经处理的草莓。
[0051]表3(抗真菌活性)和表4(每10个草莓总数中长有霉菌的草莓数)中的结果显示，与单独包含那他霉素或联苯吡菌胺的组合物相比，包含500ppm那他霉素以及1000ppm联苯吡菌胺的抗真菌组合物在限制草莓上霉菌生长方面更加成功。[0052]孵育3天后，观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性高8%，这导致> 1.0的协同因子(见表3)。
[0053]孵育5天后，用对照组合物或那他霉素任一处理的所有10个草莓均长有霉菌，用联苯吡菌胺单独处理的10个草莓中有8个长有霉菌。然而，对草莓应用那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合时，第5天10个草莓中仅5个观察到霉菌生长(见表4)。另外，第5天和第6天对包含那他霉素和联苯吡菌胺的组合物观察的抗真菌活性比预期的抗真菌活性分别超出16%和18%。因此，两天中获得的协同因子均> 1.0 (见表3)。
[0054]总而言之，该实施例的结果证明，500ppm那他霉素和1000ppm联苯吡菌胺的组合应用协同减少了草莓上的霉菌生长。
[0055]实施例5
[0056]处理草莓
[0057]如实施例3中所述进行实验，不同之处在于在新鲜制备的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷兰)、500ppm联苯批菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个有创口并且经接种的草莓各自浸溃I分钟。针对霉菌生长评价经处理的草莓。根据实施例3中所述的方法，测定个体和组合的活性成分的抗真菌活性(以％计)。
[0058]表5中的结果显示,包含250ppm那他霉素以及500ppm联苯吡菌胺的抗真菌组合物在减少草莓上霉菌生长方面优于单独包含那他霉素或联苯吡菌胺任一的组合物。
[0059]孵育4、6、7、9和10天后，观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性高10%到20%，相应的协同因子从第4天的1.2提高到第10天的> 10(见表5)。
[0060]因此,组合应用 于草莓上时，250ppm那他霉素和500ppm联苯吡菌胺之间存在抵抗真菌的强协同活性。
[0061]实施例6
[0062]处理草莓
[0063]如实施例3中所述进行实验，不同之处在于在新鲜制备的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷兰)、250ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个有创口并且经接种的草莓各自浸溃I分钟。将经处理的草莓孵育一周，并从第3天起根据实施例3中所述的一种或两种方法针对霉菌生长每天评价经处理的草莓。
[0064]表6 (每10个草莓总数中长有霉菌的草莓数)和表7 (抗真菌活性)明确证实，与单独包含那他霉素或联苯吡菌胺的组合物相比，包含250ppm那他霉素以及250ppm联苯吡菌胺的组合抗真菌组合物更有效地保护草莓抵抗霉菌生长。
[0065]孵育3天后，用对照组合物处理的所有10个草莓均长有霉菌，用那他霉素单独处理的10个草莓和用联苯吡菌胺单独处理的10个草莓中分别有8个和9个草莓长有霉菌。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物处理的10个草莓中仅有5个在第3天显示霉菌生长(见表6)。
[0066]孵育4天和5天后，用对照组合物或那他霉素任一单独处理的所有10个草莓均长有霉菌，用联苯吡菌胺处理的10个草莓中分别有9个和10个长有霉菌。然而，用那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合处理的10个草莓中，第4天和第5天仅有7个和8个草莓长有霉菌(见表6)。另外，孵育4和7天之间，观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出13%到21%。相应的协同因子因此从第4天的1.3提高到第7天的2.3(见表7)。[0067]因此，250ppm那他霉素和250ppm联苯吡菌胺的组合应用导致草莓上霉菌生长的强协同减少。
[0068]实施例7
[0069]处理蜜桔(mandarins)
[0070]每个处理组使用十个新鲜的有机蜜桔。根据de Lapeyre de Bellaire andDubois (1987)所述方法，使用木塞钻孔器对每个蜜桔的皮造成一次创伤。随后，用10μ I含有I X IO5孢子/ml的Penicillium italicum悬浮液接种每个创口。在20°C下孵育2小时后，在新鲜制备的包含500ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷兰)、2000ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将蜜桔各自浸溃I分钟。另外，抗真菌组合物包含3.1% (w/w)蜂腊、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯(Tween 60),0.03% (w/w)甲基羟乙基纤维素(MHEC),0.02% (w/w)黄原胶、0.02% (w/w)消泡剂、0.15% (w/w)柠檬酸和0.01% (w/w)山梨酸钾。组合物的pH为4。使用不含那他霉素和联苯吡菌胺的组合物作为对照。
[0071]将经处理的蜜桔在闭合箱中于暗中、20°C下孵育，并在孵育期间评价霉菌生长。根据实施例3中所述的Colby方法(Colby, 1967),通过计算与用对照组合物处理的蜜桔上的霉菌生长相比，用抗真菌组合物处理的蜜桔上观察到的霉菌生长的减少，来测定个体和组合的活性成分的抗真菌活性(以％计)。
[0072]表8中的结果证明，包含500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺的活性成分组合比单独的那他霉素或联苯吡菌胺更加成功地限制蜜桔上的霉菌生长。
[0073]孵育4、6、9、11、14和15天后，针对包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出6%到13%。上述这些天中每天相应的协同因子>1.0，并且范围是从第4天的1.2至第15天的2.8 (见表8)。
[0074]总而言之，该实施例的结果清楚地证明在蜜桔上组合应用时，500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺的协同抗真菌效应。
[0075]实施例8
[0076]处理蜜桔
[0077]如实施例7中所述进行实验，不同之处是在新鲜制备的包含500ppm那他霉素(DSMFood Specialties, Delft,荷兰)、1000ppm联苯批菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个带有创口的、经接种的蜜桔各自浸溃I分钟。根据实施例3中所述的Colby方法(Colby, 1967)评价个体和组合的活性成分在蜜桔上的抗真菌活性(以％计)。
[0078]结果(见表9)显示,包含500ppm那他霉素和1000ppm联苯吡菌胺的抗真菌组合物比单独的那他霉素或联苯吡菌胺在蜜桔上具有更强的抗真菌活性。
[0079]孵育4、6、7、9、14和15天后，针对那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性高7%到14%之间，协同因子范围从1.2到3.0(见表9)。
[0080]因此可以得出结论，500ppm那他霉素和1000ppm联苯吡菌胺的组合应用导致蜜桔上霉菌生长的协同减少。
[0081]实施例9
[0082]处理蜜桔[0083]如实施例7中所述进行实验，不同之处是在新鲜制备的包含250ppm那他霉素(DSMFood Specialties, Delft,荷兰)、500ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个带有创口的、经接种的蜜桔各自浸溃I分钟。根据实施例3中所述的Colby方法(Colby, 1967)评价个体和组合的活性成分在蜜桔上的抗真菌活性(以％计)。
[0084]结果(见表10)清楚地证明，250ppm那他霉素和500ppm联苯吡菌胺的活性成分组合比单独的那他霉素或联苯吡菌胺具有更高的抵抗蜜桔上霉菌生长的效力。
[0085]孵育4、6、7、9、11、13和15天后，针对包含那他霉素以及联苯吡菌胺的组合物观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出9%到26%，这导致范围从1.2到4.3的协同因子(见表10)。
[0086]因此，250ppm那他霉素和500ppm联苯吡菌胺的组合应用协同减少了蜜桔上的霉
菌生长。
[0087]实施例10
[0088]处理蜜桔
[0089]如实施例7中所述进行实验，不同之处是在新鲜制备的包含250ppm那他霉素(DSMFood Specialties, Delft,荷兰)、250ppm联苯吡菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个带有创口的、经接种的蜜桔各自浸溃I分钟。根据实施例3中所述的Colby方法(Colby, 1967)评价个体和组合的活性成分在蜜桔上的抗真菌活性(以％计)。 [0090]结果(见表11) 证明，包含250ppm那他霉素和250ppm联苯吡菌胺的组合物在减少蜜桔上霉菌生长方面优于单独包含那他霉素或单独包含联苯吡菌胺的组合物。
[0091]孵育3、4、6、7和9天后，针对包含那他霉素以及联苯吡菌胺的组合物观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出10%到29%。因此，上述每一天的协同因子都超过>
1.0，并且从第3天的1.1提高至第9天的3.3 (见表11)。
[0092]因此，组合应用于蜜桔上时，250ppm那他霉素和250ppm联苯吡菌胺之间存在协同的抵抗真菌的活性。
[0093]实施例11
[0094]处理苹果
[0095]每个处理组使用十个新鲜的、有机的苹果。根据Lapeyre de Bellaire andDubois (1987)所述方法，使用木塞钻孔器对每个苹果造成创伤。随后，用10μ I含有IXlO6孢子/ml的Penicillium italicum悬浮液接种每个创口。在20°C下孵育2小时后,在新鲜制备的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties，Delft，荷兰)、2000ppm联苯吡菌胺任一或二者兼有的水性抗真菌组合物中将苹果各自浸溃I分钟。另外，抗真菌组合物包含3.1% (w/w)蜂腊、0.76% (w/w)甘油、0.66% (w/w)聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯(Tween 60),0.03% (w/w)甲基羟乙基纤维素(MHEC) ,0.02% (w/w)黄原胶、0.02% (w/w)消泡剂、0.15% (w/w)柠檬酸和0.01% (w/w)山梨酸钾。组合物的pH为4。使用不含那他霉素和联苯吡菌胺的组合物作为对照。将经处理的苹果在闭合箱中于暗中和20°C下孵育。
[0096]在孵育期间，以双重方式评价苹果上的霉菌生长:(i)计数每10个苹果总数中长有霉菌的苹果数量；和(ii)根据实施例3中所述Colby方法(Colby，1967)，通过计算与用对照组合物处理的苹果上的霉菌生长相比，用抗真菌组合物处理的苹果上观察到的霉菌生长的减少，来测定个体和组合的活性成分的抗真菌活性(以％计)。[0097]表12(每10个苹果总数中长有霉菌的苹果数)和表13(抗真菌活性)中的结果显示，包含500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺的抗真菌组合物具有与单独包含那他霉素或联苯吡菌胺的组合物相比更强的抗真菌活性。
[0098]孵育3天和4天后，用对照组合物处理的所有10个苹果都长有霉菌，用那他霉素单独处理的10个苹果中9个长有霉菌，用联苯吡菌胺单独处理的10个苹果中的5个长有霉菌。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺的组合组合物处理的10个苹果中，在第3天和第4天仅观察到2个有霉菌生长(见表12)。
[0 099]孵育6天和7天后，用对照组合物或那他霉素任一单独处理的所有10个苹果都显示霉菌生长，用联苯吡菌胺单独处理的10个苹果中有8个显示霉菌生长。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物处理10个苹果导致，第6天和第7天分别仅有2和4个苹果长有霉菌(见表12)。
[0100]在孵育的9到14天期间，用对照组合物、那他霉素或联苯吡菌胺任一单独处理的所有苹果均长有霉菌，而用那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合处理的10个苹果中仅6个观察到霉菌生长(见表12)。
[0101]另外，与预期的抗真菌活性相比，对那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合观察的抗真菌活性在第3天超出14%，第6天超出几乎50%，第9到14天超出约30%。在从3到14天的孵育周期期间，协同因子总是> 1.0,并且范围是从1.2到2.1 (见表13)。
[0102]总而言之，组合应用于苹果上时，500ppm那他霉素和2000ppm联苯吡菌胺之间存在令人惊讶的强抗真菌活性。
[0103]实施例12
[0104]处理苹果
[0105]如实施例11中所述进行实验，不同之处在于在新鲜制备的含有500ppm那他霉素(DSM Food Specialties,Delft,荷兰)、1000ppm联苯批菌胺或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个有创口并且经接种的苹果各自浸溃I分钟。孵育期间，根据实施例3中所述的两种方法针对霉菌生长评价经处理的苹果。
[0106]表14 (每10个苹果总数中长有霉菌的苹果数)和表15 (抗真菌活性)中的结果显示，与单独包含那他霉素或联苯吡菌胺的组合物相比，包含500ppm那他霉素以及1000ppm联苯吡菌胺的组合物在限制苹果上的霉菌生长方面更加成功。
[0107]孵育3天和4天后，用对照组合物处理的所有10个苹果都长有霉菌，用那他霉素单独处理的10个苹果中9个长有霉菌，用联苯吡菌胺单独处理的10个苹果中的6个长有霉菌。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺的组合组合物处理的10个苹果中，在第3天和第4天分别仅观察到2个和3个长有霉菌(见表14)。
[0108]孵育6天和7天后，用对照组合物或那他霉素任一单独处理的所有10个苹果都显示霉菌生长，用联苯吡菌胺单独处理的10个苹果中分别有8个和9个显示霉菌生长。然而，用包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物处理10个苹果导致，第6天仅有4个长有霉菌的苹果，第7天仅有5个长有霉菌的苹果(见表14)。
[0109]在孵育的9到14天期间，用对照组合物、那他霉素或联苯吡菌胺任一单独处理的所有苹果均长有霉菌，而用那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合处理的10个苹果中仅6个观察到霉菌生长(见表14)。[0110]另外，在3和14天的孵育期间，对包含那他霉素和联苯吡菌胺的组合组合物观察的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出23%到> 30%。上述孵育周期中协同因子持续>
1.0，并且从第3天的1.4提高至第14天的1.7 (见表15)。
[0111]该实施例的结果清楚地显示，500ppm那他霉素和1000ppm联苯吡菌胺的组合应用协同减少的霉菌生长。
[0112]实施例13
[0113]处理苹果
[0114]如实施例11中所述进行实验，不同之处在于在新鲜制备的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷兰)、500ppm联苯吡菌胺任一或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个有创口并且经接种的苹果各自浸溃I分钟。孵育6、7和9天后，根据实施例3中所述的两种方法针对霉菌生长评价经处理的苹果。
[0115]表16 (每10个苹果总数中长有霉菌的苹果数)和表17 (抗真菌活性)中的结果显示，包含250ppm那他霉素和500ppm联苯吡菌胺二者的抗真菌组合物比单独的那他霉素更有效地限制苹果上的霉菌生长。
[0116]孵育6、7和9天后，用对照组合物、那他霉素或联苯吡菌胺任一单独处理的所有10个苹果都显示霉菌生长。然而，在用那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合处理的10个苹果中，第6、7和9天分别仅有5、6和8个长有霉菌(见表16)。另外，与预期的抗真菌活性相比，对包含那他霉素和联苯吡菌胺的组合组合物观察的抗真菌活性分别在第6天超出13 %、在第7天 超出9%和在第9天超出12%，这导致这些天中每一天协同因子都> 1.0(见表 17)。
[0117]因此可以得出结论，250ppm那他霉素和500ppm联苯吡菌胺的组合应用导致苹果上霉菌生长的协同减少。
[0118]实施例14
[0119]处理苹果
[0120]如实施例11中所述进行实验，不同之处在于在新鲜制备的含有250ppm那他霉素(DSM Food Specialties, Delft，荷兰)、250ppm联苯吡菌胺任一或二者兼有的水性抗真菌组合物中将每个有创口并且经接种的苹果各自浸溃I分钟。孵育期间，根据实施例3中所述的两种方法针对霉菌生长评价经处理的苹果。
[0121]表18 (每10个苹果总数中长有霉菌的苹果数)和表19 (抗真菌活性)中的结果证明，包含250ppm那他霉素和250ppm联苯吡菌胺二者的组合物抵抗苹果上霉菌生长的活性比单独包含那他霉素或联苯吡菌胺的组合物更强。
[0122]孵育6到15天期间，用对照组合物、那他霉素或联苯吡菌胺任一单独处理的所有苹果都长有霉菌。然而，使用包含那他霉素和联苯吡菌胺二者的组合物进行处理时，第6到9天时10个苹果中的6个长有霉菌，第11天到第15天时10个苹果中的7个长有霉菌(见表18)。另外，与预期的抗真菌活性相比，对那他霉素和联苯吡菌胺的活性成分组合观察的抗真菌活性分别在第6天超出18%、在第9天超出32%、在第11天超出25%和在第14天超出20%。这些天中每一天的协同因子都> 1.0 (见表19)。
[0123]因此，该实施例明确地证明了 250ppm那他霉素和250ppm联苯吡菌胺的组合应用在苹果上的协同抗真菌效应。[0124]实施例15
[0125]体外(In vitro)抗真菌活性
[0126]为了证实那他霉素与吡唑萘菌胺的组合针对Botrytis cinerea的协同抗真菌活性，使用96孔微量滴定板进行体外实验。测试以下的组合物:
[0127]-对照(无活性成分)，
[0128]-1.25ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷兰),
[0129]-6.25ppm吡唑萘菌胺，
[0130]-1.25ppm那他霉素+6.25ppm吡唑萘菌胺。
[0131]用84 μ I PCB培养基填充微量滴定板的每个孔后，从制备于PCB培养基或甲醇中的单独的储备溶液中添加活性成分，这导致每孔100 μ I的中间体积。随后，使用制备于PCB培养基中的100 μ I Botrytis cinerea悬浮液，以2.5χ103孢子/ml接种每个孔。因此,每个孔含有200 μ I的终体积和< 1%的甲醇,这不影响Botrytis cinerea的生长(数据未展示)O
[0132]将微量滴定板在25°C下孵育后，通过计算与无活性成分时观察到的霉菌生长相t匕，存在活性成分时观察到的霉菌生长的减少，来评价个体活性成分的体外抗真菌活性(以％计)。根据Colby方程(Colby，1967)计算活性成分组合的预期抗真菌活性(E，以％计): [0133]E = X+Y-[(X.Y)/100]
[0134]其中X和Y分别是个体活性成分X和Y的观察到的抗真菌活性(以％计)。如果组合的观察到的抗真菌活性(0，以％计)超出组合的预期抗真菌活性(Ε，以％计)并且因而协同因子0/Ε > 1.0，那么活性成分的组合应用导致协同的抗真菌效应。
[0135]结果显示，与单独的那他霉素或吡唑萘菌胺相比，那他霉素和吡唑萘菌胺(见表20)的活性成分组合更有效地抑制Botrytis cinerea的生长。针对那他霉素与吡唑萘菌胺的组合观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性高100%。因此，相应的协同因子远高于1.0。
[0136]因此，那他霉素和吡唑萘菌胺的活性成分组合协同地抑制了 Botrytis cinerea的生长。
[0137]实施例16
[0138]体外抗真菌活性
[0139]如实施例15中所述进行实验，不同之处在于测试以下的组合物:
[0140]-对照(无活性成分)，
[0141]-0.63 或 1.25ppm 那他霉素(DSM Food Specialties, Delft,荷兰),
[0142]_25ppm吡唑萘菌胺，
[0143]_25ppm联苯批菌胺，
[0144]-0.63ppm那他霉素+25ppm吡唑萘菌胺，
[0145]-1.25ppm那他霉素+25ppm联苯吡菌胺。
[0146]另外,使用Penicillium italicum接种。根据实施例15中所述方法测定个体活性成分和组合的活性成分的抗真菌活性(以％计)。
[0147]结果(见表21)显示，那他霉素+吡唑萘菌胺和那他霉素+联苯吡菌胺的活性成分组合比个体的那他霉素、吡唑萘菌胺或联苯吡菌胺更成功地抑制Penicillium italicum的生长。针对活性成分组合那他霉素+吡唑萘菌胺和那他霉素+联苯吡菌胺观察到的抗真菌活性比预期的抗真菌活性超出25%，这导致> 1.0的协同因子。
[0148]因此，那他霉素和吡唑萘菌胺的组合应用以及那他霉素和联苯吡菌胺的组合应用展示了抵抗Penicillium italicum的协同抗真菌活性。
[0149]表1.用包含500ppm那他霉素、2000ppm联苯吡菌胺任一或二者兼有的组合物处理
后，在20°C下孵育的长有霉菌的草莓数。
[0150]
【权利要求】
1.包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的组合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物选自由联苯吡菌胺、胺苯吡菌酮、氟唑菌酰胺、氟吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、吡咪唑和环苯吡菌胺组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述多烯抗真菌化合物是那他霉素。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自下组的额外的化合物，所述组由粘着剂、载剂、着色剂、保护性胶体、粘合剂、除草剂、肥料、增稠剂、掩蔽剂、触变剂、表面活性剂、其他抗微生物化合物、洗涤剂、防腐剂、铺展剂、填充剂、喷雾油、流动添加剂、矿物质、溶剂、分散剂、乳化剂、湿润剂、稳定剂、消泡剂、缓冲剂、UV-吸收剂和抗氧化剂组成。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的组合物，其中所述多烯抗真菌化合物的量在从0.005g/l到约100g/l的范围内，所述至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的量在从约0.0OOlg/Ι到约2000g/l的范围内。
6.包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的试剂盒。
7.通过用多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂的抗真菌化合物处理产品来保护产品抵抗真菌的方法。
8.根据权利要求7所述的·方法，其中用根据权利要求1到5中任一项所述的组合物或根据权利要求6所述的试剂盒来处理所述产品。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述产品选自由食品、饲料产品、药物产品、化妆品产品和农产品组成的组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述产品是农产品。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述产品在收获后被处理。
12.包含多烯抗真菌化合物和至少一种来自吡唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物的产品O
13.根据权利要求12所述的产品，其中所述产品选自由食品、饲料产品、药物产品、化妆品产品和农产品组成的组。
14.根据权利要求13所述的产品，其中所述产品是农产品。
15.多烯抗真菌化合物和至少一种来自批唑杀真菌剂家族的抗真菌化合物用于保护产品抵抗真菌的用途。
【文档编号】A01N45/02GK103547156SQ201280011557
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月3日
【发明者】雅各布斯·斯塔克, 安格里克·里克·德 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司