专利名称：一种提高杂交白杨抗虫能力的方法
一种提高杂交白杨抗虫能力的方法技术领域
本发明属于植物品种改良的生物技术，具体地涉及一种提高杂交白杨抗虫能力的方法背景技术
杨树是世界上分布最广，适应性最强的树种，是我国重要的速生用材树种之一。然而，随着环境的不断恶化，自然灾害的频繁发生，食叶害虫和蛀干害虫的危害成为大面积发展杨树丰产林的最大障碍，化学防治方法不仅成本高、污染环境，而且易使害虫产生抗药性，因此，利用基因工程方法培育具有抗虫能力的杨树新品种是控制虫害的重要途径。林木植物由于生长周期较长，总是面临周围环境中各种病虫害的侵犯，因此在长期的演化过程中，他们自身已获得了适度、有效的生物抗性机制，能够最大限度地避免逆境的危害。通过深入挖掘并利用林木植物这种自身的病虫害防御机制，利用基因工程方法培育转基因抗虫林木新品种，对发展生态林业、保护生态环境具有重要意义。
POP3是一种功能未知的创伤诱导蛋白，尚无文献资料报道其具有抗虫能力。发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高杂交白杨抗虫能力的方法。
本发明的技术方案概述如下
一种提高杂交白杨抗虫能力的方法，包括如下步骤
(I)以毛果杨(P. Trichocarpa)叶片的 mRNA 为模板，以 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 所示核苷酸序列为上、下游引物，通过RT-PCR得到了 SEQ ID No. I表示的核苷酸序列；
(2)将凝胶回收的SEQ ID No. I表示的核苷酸序列连接到pMD18_T载体上得到重组质粒并导入E. coli菌株DH5a，筛选出阳性克隆，提取质粒；
(3)将步骤(2)获得的质粒双酶切，将凝胶回收的SEQ ID No. I表示的核苷酸序列与经双酶切的植物表达载体PBI121进行连接，转化E. coli菌株DH5 a ；
(4)用SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为pBI121_P0P3 ；
(5)将PBI121-P0P3通过电击法转入根癌农杆菌C58中，得到的菌落进行菌落PCR 鉴定，大小为326bp片段的菌落即为正确的菌株；
(6)将步骤(5)获得的菌株转化杂交白杨(Populus alba L. XPopulus tremula L.)，获得提闻杂交白杨抗虫能力的转基因苗。
本发明将毛果杨中编码创伤应答蛋白POP3的基因导入杂交白杨(Populus alba L. XPopulustremula L.)中得到转基因杂交白杨,利用所述转基因杂交白杨和对照植物杂交白杨的叶片分别饲喂美国白蛾，结果证明，转基因杂交白杨对美国白蛾幼虫的致死率显著优于对照植物；转基因杂交白杨对美国白蛾幼虫生长发育的负面影响显著高于对照植物；转基因杂交白杨对美国白蛾成虫的化蛹率、羽化率、产卵量和卵孵化率的负面影响均显著高于饲喂对照植物。
本发明通过将创伤应答蛋白POP3基因遗传转化重要林木植物杂交白杨以提高其抗虫能力，利用该方法能够显著提高转基因杂交白杨对世界性检疫害虫——鳞翅目美国白蛾的抗虫能力，为培育抗虫林木提供了一种十分有效的方法，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生具有一定的意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也有重大的应用价值。
图I为来源于毛果杨的创伤应答蛋白基因cDNA的克隆。
图2为携带创伤应答蛋白基因POP3的植物表达载体图。
图3为转POP3基因杂交白杨基因组DNA的PCR检测。
图4为转POP3基因杂交白杨的RT-PCR检测。
具体实施方式
下述结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例I :转POP3杨树的获得
I、毛果杨(P. Trichocarpa)创伤应答蛋白基因cDNA的克隆
根据Genbank登录的欧洲山杨创伤应答蛋白cDNA序列(AJ276517),在毛果杨 (P. Trichocarpa)全基因组草图中进行Blastn搜索，得到的序列在Genbank的登录状态显示是一种功能未知的预测蛋白，其氨基酸序列为(XP 002314976)，基因序列为(XM 002314940)。
以毛果杨(P.Trichocarpa)叶片的 mRNA 为模板，以 Forward: 5’ -atggcaaccagaa ctccaaa-3，；(SEQ ID No. 2)和 Reverse:5，-tagtagagaaagtagtctatcacaagacgc-3> ； (SEQ ID No. 3)为上、下游引物，通过RT-PCR得到了预期大小的特异条带(SEQ ID No. I表示的核苷酸序列)，结果如图I所示。
凝胶回收PCR产物(SEQ ID No. I表示的核苷酸序列)，并将回收的PCR产物连接到PMD18-T载体上，将连接产物导入E. coli菌株DH5 α ;并筛选出阳性克隆，测序后与毛果杨(P. Trichocarpa)基因组草图比较,利用DNAMAN进行氨基酸预测后与Genbank中预测蛋白氨基酸序列(GenBank:EER)1147. I)比较，结果完全一致，表明克隆的序列正确，为毛果杨(P. Trichocarpa)损伤应答蛋白基因cDNA。
2、植物表达载体的构建
将上述阳性克隆单菌落提取质粒(POP3重组到测序载体pMDlS-T后构建的质粒)经BamHI/SacI双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收326 bp的片段，植物表达载体pBI121 经BamHI/SacI双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收载体大片段。将回收的2种片段连接后转化 E. coli菌株DH5 α，在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上用SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 筛选含有抗性质粒的菌落。对筛选出的单菌落提取质粒，并对质粒用POP3目的基因的特异性引物(SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3)进行PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为PBI121-POP3，载体图谱如图2所示。4
3、农杆菌工程菌株的制备
将上述获得的植物表达载体pBI121-P0P3通过电击法转入根癌农杆菌C58中，在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的YEB固体培养基上涂板，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，得到大小为326bp片段的菌落即为正确的菌株。将该菌株的单菌落接种到新鲜YEB培养基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中，28°C 180rpm震荡培养至0D600大约为O. 5时制得用于转化的菌液。
4、农杆菌介导的杨树遗传转化
在超净工作台上，将杂交白杨(Populusalba L. XPopulus tremula L. )2_3cm长的茎段放入上述菌液中浸泡lOmin，之后将茎段转移到共培养培养基中于23°C暗培养3天。 之后将茎段转入附加20mg/L卡那霉素的筛选培养基中，于23°C培养I个月后出现愈伤组织。将带有抗性愈伤组织的茎段转接于分化筛选培养基，大约I个月后可观察到不定芽。待不定芽长至2-3cm时沿其基部剪下，转移到生根筛选培养基，3-4周根系发育完全，获得提高杂交白杨抗虫能力的转基因苗(转POP3杨树苗)。
5、杨树转化植株的分子检测
(I)基因组DNA的PCR鉴定
用Takara 公司的 Universal genomic DNA extraction kit 提取提高杂交白杨抗虫能力的转基因苗叶片的基因组DNA，以该DNA为模板，用目的基因的特异性引物(SEQ ID No. 2、SEQID No. 3)对其进行PCR。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，I DNA marker ;2_9 :转POP3杨树苗；10 :非转基因杨树苗(阴性对照)；11 pBI121-P0P3质粒 (阳性对照)。从图中可以看出，转POP3杨树苗和阳性对照均能扩增得到326bp的特异性条带，证明POP3已经整合进杨树基因组中。
(2) RT-PCR 检测
用QIAGEN公司的RNeasy mini kit提取转POP3杨树苗叶片的总RNA，以该RNA 为模板进行cDNA合成(iScript cDNA Synthesis kit, BioRad),用目的基因的特异性引物 (SEQ IDNo. 2,SEQ IDNo. 3)对反转录产物进行RT-PCR分析。结果如图4所示，I =DNAmarker ； 2-4 -M POP3杨树苗；5 :非转基因杨树苗(阴性对照)；6 pBI121-P0P3质粒(阳性对照)；。 从图中可以看出，转POP3杨树苗和阳性对照均能扩增得到326bp的特异性条带，证明POP3 已经在转基因杨树苗叶片中表达。
共培养培养基包括MS盐4. 4g，蔗糖30g，生长素NAA I. 86mg，细胞分裂素2ipI.02mg, pH=5. 7,乙酰丁香酮 19. 86mg,琼脂 7. 2g，加水至 1L。
筛选培养基包括MS盐4. 4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ O. 05mg,pH=5. 7，头孢霉素 350mg,卡那霉素20mg,琼脂7. 2g，加水至1L。
分化筛选培养基包括MS盐4. 4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ O. 0022mg,pH=5. 7，头孢霉素350mg,卡那霉素20mg,琼脂7. 2g,加水至1L。
生根筛选培养基包括MS盐2. 2g，蔗糖30g，pH=5. 7，头孢霉素350mg，卡那霉素 20mg，琼脂7. 2g，加水至IL0
实施例2 :转POP3杨树苗的抗虫能力研究
I、美国白蛾的群体饲养
在室内常温条件下孵化美国白蛾卵块，将刚孵化的美国白蛾I龄幼虫放在清洁干燥的罐头瓶中，用转POP3杨树苗和非转基因杨树苗的叶片分别喂饲幼虫，用透气纱布扎紧瓶口，保证叶片新鲜、充足。每瓶30只，设6个重复。将培养瓶置于(25±2) °C，相对湿度 (RH) 70%-80%的生化培养箱中培养。饲养3周时统计各处理美国白蛾幼虫的体重和体长； 化蛹前统计存活情况，计算死亡率；记录每次饲喂叶片重量和剩余叶片重量，计算与对照相比的取食量；化蛹后统计化蛹率和平均蛹重；羽化后统计羽化、产卵量和孵化情况。
2、转POP3杨树苗对美国白蛾的抗虫能力分析
(I)转POP3基因杨树苗对美国白蛾幼虫生长发育的影响
分别用不同株系的转POP3杨树苗和非转基因杨树苗(阴性对照)叶片饲养美国白蛾初孵幼虫，饲养3周时统计各处理美国白蛾幼虫的体重和体长，饲喂非转基因杨树苗的幼虫平均体重为318mg，平均体长2. 8cm，化蛹后的平均蛹重为187. lmg，而饲喂转POP3杨树苗的幼虫平均体重和体长及蛹重均显著降低，说明转POP3杨树苗对美国白蛾幼虫的生长发育影响高于非转基因杨树苗。化蛹前饲喂非转基因杨树苗使美国白蛾幼虫的总死亡率为3.1%，而饲喂转POP3杨树苗使幼虫的总死亡率显著提高达48. 3%-52. 0%，表明转POP3杨树苗对美国白蛾幼虫的致死作用高于非转基因杨树苗。结果见表I。
表I转POP3杨树苗和非转基因杨树苗(对照)对美国白蛾幼虫生长发育的影响
权利要求
1.一种提高杂交白杨抗虫能力的方法，其特征是包括如下步骤(1)以毛果杨(P.Trichocarpa)叶片的 mRNA 为模板，以 SEQ ID No. 2, SEQ IDNo. 3 所示核苷酸序列为上、下游引物，通过RT-PCR得到了 SEQ ID No. I表示的核苷酸序列；(2)将凝胶回收的SEQID No. I表示的核苷酸序列连接到pMD18_T载体上得到重组质粒并导入E. coli菌株DH5a，筛选出阳性克隆，提取质粒；(3)将步骤(2)获得的质粒双酶切，将凝胶回收的SEQID No. I表示的核苷酸序列与经双酶切的植物表达载体PBI121进行连接，转化E. coli菌株DH5 a ；(4)用SEQID No. 2,SEQ ID No. 3筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为pBI121_P0P3 ；(5)将pBI121-P0P3通过电击法转入根癌农杆菌C58中，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，大小为326bp片段的菌落即为正确的菌株；(6)将步骤(5)获得的菌株转化杂交白杨(Populusalba L. XPopulus tremulaL.),获得提闻杂交白杨抗虫能力的转基因苗。
全文摘要
本发明公开了一种提高杂交白杨抗虫能力的方法，步骤为以毛果杨叶片的mRNA为模板，以SEQ ID No.2、3为引物，通过RT-PCR得到了SEQ ID No.1并连接pMD18-T，得到的重组质粒导入E.coli菌株DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒并双酶切，将SEQ ID No.1与经双酶切的pBI121进行连接，转化E.coli菌株DH5α；筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒进行PCR验证、双酶切验证，挑选正确的重组子，命名为pBI121-POP3并转入根癌农杆菌中，进行菌落PCR鉴定；获得的菌株转化杂交白杨，得到转基因苗。本发明的方法能提高杂交白杨抗虫能力。
文档编号A01H5/00GK102925482SQ201210464809
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者王洁华, 杨少辉, 宋英今 申请人:天津大学