专利名称：烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花的利记博彩app
技术领域：
本发明是一种烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT (Flowering locus T)基因NtFTl及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。
背景技术：
植物开花是一个非常复杂的过程，受到外部环境因素和内部基因表达的影响调控。对拟南芥开花分子机理的研究表明，拟南芥的开花受四条途径控制，即光周期、自主途径、春化途径和赤霉素途径，光周期途径信号经CO (CONSTANCE)传递给FT(Flowering LocusT)，春化途径和自主途径信号经FLC (Flowering Locus C)传递给FT，FT基因的表达诱导诱导花分生组织特异基因APl的表达，从而诱导开花。FT基因是控制植物开花信号的汇集点，所以FT基因在诱导植物早花的基因工程研究中应用也最为广泛、最为有效。FT基因编码的蛋白质属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族。不同作物的FT基因高度保守，这为分离克隆FT基因提供了方便。转基因研究表明，过量表达FT基因能够诱导拟南芥早花。另外从水稻、番茄、杨树、柑橘等中克隆的FT基因的同源基因Hd3a、SFT、PtFTl和CiFT等也都能够诱导植物早花。利用植物病毒载体表达外源基因是新近发展起来的一种基因瞬时表达方法。与转基因方法相比，该方法操作简单，可在短期内使外源基因迅速表达，而且能同时对多个品种进行感染。马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)作为外源基因的病毒表达载体被广泛应用。其载体构建策略是将外源基因插入重复的CP (Coat Protein)启动子之间，利用CP基因的启动子来指导外源基因 的表达。烟草是我国主要经济作物之一。普通栽培烟草是短日照作物。我国烟草育种工作虽然取得了明显的成绩，但目前生产上的主栽品种比较单一。急需加大烟草品种选育工作的进度。烟草生育期比较长，是限制烟草育种进程的一个主要因素。拟南芥FT基因能够有效缩短烟草开花时间，而且北卡州立大学烟草育种组已经将该技术成功应用于烟草育种。但是，由于FT基因受国际专利保护，限制了我国烟草育种家对该基因的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，将源自烟草的控制植物开花时间的NtFTl基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。NtFTl基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。以此序列涉及出一对NtFTl基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。本发明另一个目的在于还构建了 NtFTl基因的PVX病毒表达载体,构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。将NtFTl基因的PVX病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。本发明是这样完成的本发明提供一个首次从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA，命名为NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1ο本发明提供一对从烟草中克隆烟草NtFTl的PCR引物。引物序列为正向引物NtFT1-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。本发明提供一种从烟草中克隆烟草NtFTl基因的方法。具体而言，首先利用拟南芥FT基因序列作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastx程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH969747.1)，利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸得到IOOOObp左右的基因组序列信息。通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1所示。根据候选序列设计PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R。取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon(Invitrogen)试剂提取 RNA,用 SuperScript RT Kit (Invitrogen)合成 cDNA 第一链,然后用NtFTl-F和NtFTl-R进行RT-PCR (图1)，PCR产物测序结果与候选序列100%—致。扩增所述基因的全长或基因中任一片段的引物对属于本发明的保护范围。本发明还提供了 NtFTl基因编码的多肽序列，其特征在于具有如SEQ ID N0:2所示的177个氨基酸序列。本发明的另一目的是这样完成的构建烟草NtFTl基因的病毒瞬时表达载体具体过程如下，将已构建的拟南芥FT基因的PVX表达载体pCAM pGR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段`质粒片段。由于NtFTl基因里有Sal I酶切位点，所以在扩增NtFTl cDNA片段的正反引物上分别引物Cla I和Xho I (F: ATCGATATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所示为 Cla I 酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下划线所示为Xho I酶切位点)，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR产物经测序验证后与上述回收的载体片段连接，获得NtFTl PVX瞬时表达载体pCAM pGR106_NtFTl。构建好的载体进行酶切验证(图2)。本发明还提供了 NtFTl基因在调节烟草开花中的应用。将上述PVX病毒表达载体pCAM pGR106-NtFT转化农杆菌菌株GV3101，经农杆菌渗滤后，使NtFTl在受体烟株中瞬时表达，促使烟草在渗滤后40 50天开花。构建的重组载体(pCAM pGR106_NtFTl)能够诱导烟草早花，应用于烟草育种，可以缩短烟草开花时间，达到缩短育种年限的目的，这方面的应用同时受本发明的保护。除上述构建的PVX病毒载体外，利用所述基因构建的其他瞬时表达载体、转基因植物表达载体或利用所述基因任何部分片段构建的RNA干涉载体，都在本发明的保护范围之内。本发明还保护利用所述基因及任何部分片段进行的转基因研究。
图1为NtFTl基因全长cDNA片段的RT-PCR扩增电泳图谱。图2为NtFTl基因PVX瞬时表达载体的酶切验证电泳图谱。其中pCAM pGR106-NtFT酶切验证，用Cla I和Sal I酶切得到389bp片段。
图3来源于不同植物的FT基因的多序列比对。图4 A为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟红花大金元。图4 B为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟云烟87。图4 C为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟K326早花。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。任何在本发明基本精神上地改进或替代，仍属于本发明权利要求书所要求保护地范围。下述实施例中地实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到地试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。NtFTl基因cDNA序列信息的获得首先利用拟南芥FT基因氨基酸序列(AEE34381.1)作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastn程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH969747.1),一致性为68%。利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸，得到IOOOObp左右的基因组序列信息。通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的⑶S区序列。根据候选序列设计扩 增基因全长cDNA的PCR引物，正向引物=NtFTl-F:ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。NtFTl基因全长CDS的克隆取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon( InvitrogenHi剂提取RNA,具体步骤如下叶片用液氮研磨IOOmg叶片成粉末后,转入已加有Iml Trizol的1.5ml离心管中，剧烈震荡使粉末分散，使细胞裂解完全。15 3°C孵育5 min，加入
0.2ml氯仿，用力振摇15 sec。15 30°C下孵育2 3min, 12，OOOg 4°C离心15min,小心吸取上层无色液体移入一新的1. 5ml离心管中。加入O. 5ml异丙醇，混匀，15 30°C下孵育IOmin, 12, OOOg 4°C离心15min。去上清，沉淀加入Iml DEPC水配制的75%乙醇，轻微振荡15 sec, 7, 500g 4°C离心5min。小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3 5min。加入30 50μ1 DEPC水溶解，_80°C冰箱保存。提取的RNA经分光光度计(NenoDrop)测定浓度并用甲醛变性电泳检测完整性。用SuperScript RT Kit (Invitrogen)合成 cDNA 第一链，然后用 NtFTl-F 和NtFTl-R 进行 RT-PCR (图 1)，PCR 反应体系cDNA 模板 μ ，5Χ Phusion HF Buffer 4μ1,dNTP (10mM)0. 4μ1,正反向引物各 μ (10M-M), Phusion DNA Polymerase 0·2μ1,灭菌蒸懼水补足20μ1。PCR扩增条件为98°C预变性30sec ;98°C变性lOsec，58°C退火30sec，72°C延伸15sec，35个循环；72°C延伸7min。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后连接、测序。测序结果与候选序列100%—致，序列见SEQ ID NO:1。NtFTl序列分析FT基因属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族，利用预测的NtFTl蛋白序列在NCBI利用Protein Blast搜索同源序列，NtFTl蛋白序列与番茄(AA031792，一致性95%, E value :le-120)、黄瓜(BAH28253，一致性 88%，E value :7e_113)、梅(BAH82787，一致性 89%，E value :6e-112)、番木瓜(ACX85427，一致性 90%，E value :4e_112)、荔枝(AEU08962，一致性87%，E value :le-111)等的FT基因同源性较高。将以上序列及拟南芥FT基因(AF152096)进行多序列比对，NtFTl含有PEBP家族典型的保守结构域DPDxP、氨基酸残基Hi s、GxHR, χΥΝ、氨基酸残基Q等(图3 )。NtFTl PVX病毒表达载体的构建构建了 NtFTl基因的PVX瞬时表达载体。具体过程如下，将载体pCAM PGR106-FT用Cla I和Sal I切下，回收大片段质粒片段。由于NtFTl基因里有Sal I酶切位点，所以在扩增NtFTl cDNA片段的正反引物上分别引入Cla I和Xho I (F: ATCGATATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所示为 Cla I 酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下划线所示为Xho I酶切位点)酶切位点，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR产物经测回收后连入PCR2.1载体，并测序。测序结果正确的克隆提取DNA，进行酶切，并与上述回收的载体片段连接，获得NtFTl PVX瞬时表达载体pCAM pGR106_NtFTl。构建好的载体进行酶切验证(图2)。表达载体导入农杆菌农杆菌GV3101感受态细胞置于冰上解冻，加入2Pg pCAM pGR106_NtFT质粒DNA，轻敲离心管混匀，冰上放置30min，置于液氮中lmin，迅速转入37°C水浴5min，在冰上放置2min左右，加入Iml不含抗生素的LB培养基，于28°C振荡培养2h ;取200μ1涂布于含卡那霉素(100mg/L)和利福平(25mg/L)的LB培养基上，28°C培养2天。利用菌落PCR方法检测阳性克隆。农杆菌渗滤使NtFTl瞬时表达诱导烟草早花渗滤液准备将穿刺培养的含有pCAM pGR106-NtFT的农杆菌菌种接种于3ml含有卡那霉素的YEP培养基，28°C过夜振荡培养；第二天，将Iml培养物转入50ml含有MES 和抗生素的 YEP 培养基(45ml YEP，5ml IOOmM 的 MES，50μ1 25 mg/L 的利福平，50μ1100 mg/L的卡那霉素，6. 67μ1 150mM)，28°C过夜振荡培养；第三天，分光光度计检测培养物00_，600(^，41离心15 111丨11，去上清，利用渗滤131^€61 (IOmM MgCL2, IOmM MES, 150μΜacetosyrigone)重悬菌体,并调整菌液浓度(OD6tltl大约为I)。烟草农杆菌渗滤烟草品种为红花大金元、云烟87和K326,利用4 5片叶的烟苗(播种后40天左右)进行渗滤。选取下部两片叶进行渗滤，并提前用记号笔标记。具体渗滤过程为，用3ml一次性注射器吸取渗滤液，轻轻压注射器，用手指在叶片正面支撑，使渗滤液轻轻渗入叶片背面，可能需要多次操作，直到整个叶面湿润为止。以空载体pCAM pGR106和渗滤buffer为对照。渗滤pCAM pGR106-NtFTl处理在渗滤后40 50天开花，而空质粒(pCAM PGR106)和buffer处理仍处于营养生长阶段(图4)。说明NtFTl具有促进烟草开花的功能。
权利要求
1.一种烟草NtFTl基因的CDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在于从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA，命名为NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在于所述的NtFTl基因编码的多肽序列，具有如SEQ ID NO:2所示的177个氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在从烟草中克隆烟草NtFTl的PCR引物，引物序列为正向引物NtFTl-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC ；反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。
4.根据权利要求1或2所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在从烟草中克隆烟草NtFTl基因的具体方法如下，首先利用拟南芥FT基因序列作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastx程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH969747.1),利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸得到IOOOObp左右的基因组序列 目息；通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1 ；根据候选序列设计PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R,取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon (Invitrogen)试剂提取RNA,用SuperScript RT Kit(Invitrogen)合成cDNA第一链，然后用NtFTl-F和NtFTl-R进行RT-PCR，PCR产物测序结果与候选序列100%—致。
5.根据权利要求3所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在扩增所述基因的全长或基因中任一片段的引物对。
6.根据权利要求1或2所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在构建烟草NtFTl基因的病毒瞬时表达载体具体过程如下，将已构建的拟南芥FT基因的PVX表达载体pCAM pGR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段质粒片段；NtFTl基因里有Sal I酶切位点，在扩增NtFTl cDNA片段的正反引物上分别引物ClaI和 Xho IF: ATCGAT ATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所示为 Cla I 酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下划线所示为 Xho I 酶切位点，Xho I是Sal I的同尾酶；PCR产物经测序验证后与上述回收的载体片段连接，获得NtFTl PVX瞬时表达载体pCAM pGR106-NtFTl。
7.烟草NtFTl基因在调节烟草开花中的应用，其特征在于将上述PVX病毒表达载体pCAM pGR106-NtFT转化农杆菌菌株GV3101，经农杆菌渗滤后，使NtFTl在受体烟株中瞬时表达，促使烟草在渗滤后40 50天开花。
8.构建的重组载体(pCAM pGR106-NtFTl)作为能够诱导烟草早花，应用于烟草育种。
全文摘要
本发明涉及一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT(Flowering locus T)基因NtFT1及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。本发明公开了源自烟草的控制植物开花时间的NtFT1基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。NtFT1基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。以此序列涉及出一对NtFT1基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。本发明还构建了NtFT1基因的PVX病毒表达载体，构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。将NtFT1基因的PVX病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。
文档编号A01H5/00GK103045609SQ20121046213
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者高玉龙, 谢贺, 肖炳光, 李永平 申请人:云南省烟草农业科学研究院