专利名称：一种海藻生物饲料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻发酵生物饲料的制备方法，尤其涉及一种利用复合菌种为原料制备海藻发酵生物饲料的方法。
背景技术：
海藻是一种生活在海洋里的含叶绿素或其他辅助色素的低等自养植物，能进行光合作用，把海洋中的无机质转化为有机质。海藻类植物资源丰富，种类繁多。目前发现的海藻类植物约有I万多种，可分为绿藻门、褐藻门、蓝藻门和红藻门等10个门类，按形态分为大型海藻和微藻两类，其中，大型海藻有褐藻中的海带、裙带菜、巨藻，绿藻中的苔条、石药以及红藻中的紫菜、石花菜等，微藻是形态最小的单细胞海藻，其直径只有几微米，但贮量巨大。海藻经过加工可制成海藻粉。海藻粉中淀粉含量达25%，蛋白质含量12 50%，并含有各种常量和微量元素，特别富含维生素A、B1、B2、B6、B12、C、烟酸、叶酸和胡萝卜素。海藻所含的微量元素和各种维生素的量远超过陆地植物，海藻具有极高的营养又和保健功效。同时，海藻中含有海藻多糖、甘露醇、丙稀酸、核苷类、萜类、大环内酯和生物碱等生物活性物质。近年来，对大型海藻的生物活性物质的研究已引起广泛的兴趣，并已开发出紫菜多糖、褐藻淀粉硫酸脂、藻酸双脂钠(PSS)、肾海康等多种海藻药物。海藻中的抗病、抗应激因子如丙烯酸、萜烯类、溴化酚类和某些含硫化合物等，对许多病原菌(如金黄色葡萄菌、大肠杆菌等)均有抑制作用，对提高水产动物的免疫力及对环境的适应能力、耐低氧能力有很大帮助。分布较广的多节泡叶藻(Ascophyllum nodosum)含有酹类物质,具有广谱强抗微生物作用。从漂浮马尾藻(Sargassumnatans)中萃取分离出的马尾藻素复合物能抑制金色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形菌的生长。石药(Ul-valinza)、车网藻(cystophyllumhakodatense)、钝形凹顶藻(Iaurenciaobtusa)因含有溴酹化合物、職烯类等,具有抗生素的特性。海藻中的抗菌物质不 会使细菌产生抗药性，对环境不会造成不良的影响，在生产上有一定的应用价值。从海藻中可分离出硫酸多糖。硫酸多糖能够与病毒结合形成非感染性的多糖一病毒复合物，干扰病毒的吸附和透入过程(Ehresmann假说)。Venkateswaran等用海藻多糖进行抗原HBsA和抗体ant1-HBs结合的抑制试验。试验表明在浓度O. 5%时，鹿角菜属(Pelvetia fastigiata)多糖的抑制率为 91% ( ±2. 2%);墨角藻(Fucus disticus)硫酸酯多聚糖的抑制率为92. 9% ;卡拉胶(λ、Κ、τ )为6±2%。在组织培养中，硫酸多糖这类天然聚阴离子性物质均不利于如小核糖核酸病毒、粘病毒、疱疹病毒等多种动物病毒的生长。李凡等从海带中提取褐藻糖胶，试验发现，这种多糖混合物可抗RNA病毒和DNA病毒。在石花菜属和皱波角叉菜属的海藻中都发现有抗病毒活性的硫酸多糖存在。我国的海藻粉生产及应用还处于起步阶段。现在技术中，海藻饲料的制备方法都还存在着不足，如生产成本高、周期长、养殖效果作用不明显等问题。
发明内容
本发明提供了一种利用多种菌种发酵海藻、提高海藻发酵生物饲料的营养价值的、生产成本低、周期短的海藻发酵生物饲料的制备方法。本发明的技术方案为一种海藻发酵生物饲料的制备方法，包括以下步骤步骤一、使用按重量计15 25份放线菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢杆菌、20 35份干酪乳杆菌和20 35份乳酸菌中的两种或两种以上制备复合菌剂；步骤二、使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述复合菌剂的制备过程包括以下步骤(I)按照所述步骤一的重量比分别称取所选择的菌种，并对各菌种单独进行培养；(2)按照与所述步骤(I)的比例，将单独培养得到的各菌液混合。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤二中，使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻，通过以下过程实现将海藻制备成海藻固体发酵培养基，将复合菌剂按1:25 30的比例接种于海藻固体发酵培养基中发酵，发酵温度为30 35°C，发酵时间为8 10天。 优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，将复合菌剂接种于海藻固体发酵培养基中，还向海藻固体发酵培养基中添加O. 05% O. 2%的植酸质。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，复合菌剂发酵海藻固体发酵培养基的发酵产物的PH值为4. 5^6. 0，水分的质量含量为40%。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，还包括步骤三、将所述步骤二的发酵产物干燥，干燥温度为4(T45°C，干燥时间为14 16h，干燥完成后发酵产物的水分在12%以下。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，放线菌的培养方法为将放线菌的菌种培养成种子液，将种子液接种于放线菌发酵培养基中进行第一次发酵，第一次发酵条件为在25 30°C下振荡培养5天，将第一次发酵的发酵液再接种于放线菌发酵培养基内进行第二次发酵。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，枯草芽孢杆菌的培养方法为将枯草芽孢杆菌的菌种接种于枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵，其中，枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂，干酪乳杆菌的培养方法为将干酪乳杆菌的菌种接种于干酪乳杆菌的发酵培养基中发酵，其中，干酪乳杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂。优选的是，所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，乳酸菌的培养方法为将乳酸菌的菌种接种于乳酸菌的发酵培养基中发酵，当检测到乳酸菌的发酵培养基内的活菌总数达到20亿/ml，且乳酸菌的发酵培养基内的液体的pH值达到3 4时停止发酵。本发明具有以下有益效果(I)本发明采用放线菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和乳酸菌制备复合菌齐U，对海藻进行发酵，利用多种菌种之间的协同作用，在产生大量的纤维素酶类降解纤维的同时，充分利用无机氮源和有机氮源以及纤维分解产生的糖类合成菌体蛋白，本发明的海藻发酵生物饲料比海藻具有含量更高的必需氨基酸，营养价值更高，动物吸收快，日增重可提高47%，免疫力增强，血清碱性磷酸酶活性提高15%，丙氨酸转氨酶活性提高6%，养殖效果作用更明显。(2)本发明中复合菌剂的制备过程为对放线菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和乳酸菌进行单独的液体培养，再将培养完成的菌液混合后用于海藻的固体发酵，上述过程保证了菌种的高速生长，有效控制生产周期，降低生产成本，固体发酵过程则使得代谢广物完成保留。(3)本发明的海藻发酵生物饲料所含的高浓度乳酸能显著提高水产动物的消化吸收功能，同时肽聚糖增加了水产动物对病原体的免疫能力。(4)枯草芽孢杆菌和乳酸菌发酵海藻，在产生多肽与氨基酸的同时，能够提高纤维素的分解，提高了养殖动物对海藻发酵生物饲料的吸收和利用，为养殖动物提供最佳的营养生长条件。(5)在复合菌剂发酵海藻的过程中，向海藻固体发酵培养基中添加植酸质作为产物促进剂，大大提高发酵过程中酶活和产物的数量。(6)利用混合菌种发酵海藻制备海藻发酵生物饲料，提高了海藻的利用率，降低了生产成本，同时使用常用的发酵及生产设备，易于在动物养殖中推广。(7)本发明采用农业部658公告允许添加的微生物菌种，在养殖动物体内无有害残留，同时减少了抗生素在养殖中的使用量，提供了一种安全、绿色的生物饲料，本发明的海藻发酵生物饲料适用于禽畜、宠物与水产动物等的养殖。
图1为本发明的海藻发酵生物饲料的制备方法的工艺流程图。
具体实施例方式如图1所示，本发明提供一种海藻发酵生物饲料的制备方法，包括以下步骤步骤一、使用按重量计15 25份放线菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢杆菌、20 35份干酪乳杆菌和20 35份乳酸菌中的两种或两种以上制备复合菌剂；步骤二、使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述复合菌剂的制备过程包括以下步骤(1)按照所述步骤一的重量比分别称取所选择的菌种，并对各菌种单独进行培养；(2)按照与所述步骤(I)的比例，将单独培养得到的各菌液混合。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤二中，使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻，通过以下过程实现将海藻制备成海藻固体发酵培养基，将复合菌剂按1:25 30的比例接种于海藻固体发酵培养基中发酵，发酵温度为3(T35°C，发酵时间为8 10天。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，将复合菌剂接种于海藻固体发酵培养基中，还向海藻固体发酵培养基中添加O. 05% O. 2%的植酸质。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，复合菌剂发酵海藻固体发酵培养基的发酵产物的pH值为4. 5^6. O，水分的质量含量为40%。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，还包括步骤三、将所述步骤二的发酵产物干燥，干燥温度为4(T45°C，干燥时间为14 16h，干燥完成后发酵产物的水分在12%以下。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，放线菌的培养方法为将放线菌的菌种培养成种子液，将种子液接种于放线菌发酵培养基中进行第一次发酵，第一次发酵条件为在25 30°C下振荡培养5天，将第一次发酵的发酵液再接种于放线菌发酵培养基内进行第二次发酵。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，枯草芽孢杆菌的培养方法为将枯草芽孢杆菌的菌种接种于枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵，其中，枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂，干酪乳杆菌的培养方法为将干酪乳杆菌的菌种接种于干酪乳杆菌的发酵培养基中发酵，其中，干酪乳杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂。所述的海藻发酵生物饲料的制备方法中，所述步骤(I)中，乳酸菌的培养方法为将乳酸菌的菌种接种于乳酸菌的发酵培养基中发酵，当检测到乳酸菌的发酵培养基内的活菌总数达到20亿/ml，且乳酸菌的发酵培养基内的液体的pH值达到3 4时停止发酵。我国微生物资源丰富，用于工业发酵的微生物主要包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。饲料工业常用的细菌包括枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌等，其适宜生长 温度是30 37°C，适宜pH为7. O 7. 2 ;常用的放线菌适宜生长温度是25 30°C，适宜pH为7. O 7. 2 ;常用的酵母菌包括啤酒酵母、假丝酵母和红酵母，适宜的生长温度是24 32°C，适宜pH为3. O 6. O ;常用的霉菌包括黑曲霉、米曲霉、白地霉和木霉，其适宜的生长温度是25 30°C，适宜pH为3. O 6. O。酵母或细菌等单细胞菌类能够产生单细胞蛋白(SPC)，多细胞的丝状真菌类能够产生菌体蛋白(MBP)。本发明所使用的菌种均为通常认为是安全的可直接饲用的微生物菌种，包括酵母菌、放线菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌。本发明中采用由江苏畜牧兽医职业技术学院营养饲料研究所保存的放线菌(Actinomycetes,简写为Am-1 )、酵母菌(Saccharomyces,简写为SC-2)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis,简写为BS-2)、干酿乳杆菌(Lactobacillus casei LC-15)、乳酸菌(Lactobacillus,简写为 LB-1 )。放线菌是一类具有线状结构的革兰氏阳性细菌，在放线菌的生活周期中，基生菌丝逐步发育成气生菌丝，并在气生菌丝上形成分生胞子。放线菌是一种能产生多种有益代谢产物且具有很高经济价值的菌种，如放线菌是产生抗生素活性物质最大的一类原核微生物。到目前为止从放线菌的代谢产物中发现的具有生物活性的物质大约有12000种，大约占整个天然生物活性物质的50%左右。放线菌群具有较强的分解复杂含氮和不含氮有机物的能力，对自然界物质转化和土壤改良起着重要作用。饲用芽抱杆菌是一类好氧菌，能在一定条件下产生芽抱，具有耐高温，耐酸碱和耐压等特点。目前所用的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌以及东洋芽孢杆菌等有益的种类。它们的特点是可以产生大量的胞外酶(蛋白酶、淀粉酶和半纤维素水解酶等)，这些酶类可以促进饲料的消化和吸收，提高饲料的利用率，从而促进动物生长。枯草芽孢杆菌生长环境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α 淀粉酶、纤维素酶、β 葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。乳酸菌是一类可以分解糖类产生乳酸的细菌的总称，通常为厌氧或兼性厌氧生长，缺点是大部分乳酸菌不耐高温，经80°C处理5分钟，死亡率在70% 80%，所以在颗粒饲料制备过程中损失率较大。但这类菌能耐酸，在PH值为3到4. 5时仍能生长，对胃的酸性环境有一定的耐受性，在动物体内可以通过生物拮抗、降低PH值来阻止和抑制致病菌的进入和定植，减少亚硝氨、氨、粪臭素等有害物质的产生，维持肠道中正常的生态平衡。乳酸菌在动物肠道内繁殖可以产生多种抑制性化合物，包括细菌素、类细菌素类物质以及各种对抗性物质，如过氧化氢和某些有机酸等。保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌，均为乳杆菌属，厌氧和兼性厌氧，耐酸，最适PH通常是5. 5 5. 8或更低些。干酪乳杆菌发酵核糖成乳酸和乙酸，不产生C02。典型的酵母菌是单细胞真菌，具有氧化和发酵两种代谢方式，能特征性发酵一系列碳水化合物，以出芽方式进行无性 繁殖。酵母指以碳水化合物(淀粉、糖蜜，以及味精、造纸、酒精等高浓度有机废液)为主要原料，经液态通风培养酵母菌，并从其发酵醪中分离酵母菌体(不添加其它物质)，酵母菌体经干燥后制得的产品。酵母所含有的营养物质极为丰富。其中，蛋白质含量可高达40% 80%，比大豆高10% 20%，比肉、鱼、奶酪高20%以上；氨基酸的组成较为齐全，含有人体必需的8种氨基酸，尤其是谷物中含量较少的赖氨酸。由于枯草芽孢杆菌是产芽孢菌，后期发酵液体呈碱性，而两种乳酸菌是典型的酸性培养细菌，所以直接复合培养有很大的难度，因此本发明对各菌种进行单独的液体培养，然后再将培养后的菌种混合后进行海藻固体发酵培养基的固体发酵，既保证了各菌种活菌数量，保证各菌种具有高速的生产速度，又在固体发酵过程中最大程度的保留代谢产物，保证了海藻发酵生物饲料的应用效果。实施例一步骤一生产菌种的制作将筛选的放线菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，将酵母菌转接入酵母膏麦芽汁琼脂作培养基的茄子瓶中，在35°C温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2 6°C的冰箱中进行保存；营养琼脂培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g, NaCl 5g，琼脂15 20g、水1000ml, PH7. O 7. 2。121。。灭菌 20min。淀粉培养基蛋白胨10g、NaC15g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水、琼脂15 20g, 121°C灭菌 20min。有益菌株的液体培养(I)按以下重量百分比例称取各菌种放线菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢杆菌30g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g。( 2 )放线菌的液体培养挑取活化的放线菌的菌种接种于装有30ml种子培养基的IOOml三角瓶中，28°C，180r/min下培养24h作为活化的种子液。再进行摇瓶培养，进行第一次发酵，取Iml种子液接入装有50ml放线菌的发酵培养基的250ml三角瓶中，28°C，180r/min条件下振荡培养5天。将放线菌的发酵培养基在8000r/min下离心15min,取上清液备用，上清液即发酵液。将第一次发酵的发酵液按放线菌发酵培养基的5%接种到放线菌发酵培养基中，混合均匀，压实、密封发酵，时间3d。放线菌的发酵培养基的成分为可溶性淀粉2g、硝酸钾O. lg、磷酸氢二钾O. 05g、氯化钠O. 05g、硫酸镁O. 05g、硫酸亚铁O. OOlg、琼脂2g以及水1000ml。放线菌的发酵培养基的制备过程为把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95mL水，搅匀后加入其他物质，使其他物质溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH值到7. 2 7. 4，分装后灭菌，备用。(3)酵母菌的液体培养将酵母菌的菌种接种于酵母菌发酵培养基中发酵。酵母菌的发酵培养基的成分为蔗糖3g、NaNO3O. 3g、K2HPO4O. lg、KC10. 05g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、FeSO4O. OOlg、琼脂1. 5 2g 以及蒸馏水 100ml, ρΗ7· 0 7· 2，灭菌20mino(4)枯草芽孢杆菌的液体培养将称取的枯草芽孢杆菌的菌种按重量比1:25的比例接种于12rC、30min高温灭菌的枯草芽孢杆菌的发酵培养基中，发酵时通气量维持在1:1，发酵时间28h，待PH值上升到7. 5时停止发酵。枯草芽孢杆菌的发酵培养基的成分为豆柏粉2g、大豆粉1. 5g、硫酸铵0. 5g、玉米淀粉3g、糖蜜10g、磷酸二氢钾0. 2g、磷酸二氢钠0. 3g、磷酸镁0.1g以及无菌水82. 4g，其中还添加0. 05% 0. 2%的植酸质作为产物促进剂。(5)干酪乳杆菌的液 体培养将称取的干酪乳杆菌按重量比1:30比例接种于123°C、45min高温灭菌的干酪乳杆菌的发酵培养基中，发酵时通气量维持在1:1，发酵时间28小时，待PH值上升到7. 5时
停止发酵。干酪乳杆菌的发酵培养基的成分为牛肉膏5g、蛋白胨10g、乳糖5g、吐温80(Tween 80) lg、L_ 半胱氨酸 0. lg、H20 1000ml,pH 7，121°C,灭菌 15min。其中，在干酪乳杆菌的发酵培养基中添加0. 05% 0. 2%的植酸质作为产物促进剂。(6)乳酸菌的液体培养本实施例中选择植物乳杆菌和干酪乳杆菌进行乳酸菌的液体培养。将称取的植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合在一起进行复合培养。将混合菌苔按重量比1:25的比例接种于12rC、30min高温灭菌的乳酸菌的发酵培养基中，接种后液体在发酵罐中搅拌30min，发酵罐的转速为220r/min，搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5 7天，静置过程中每天测定发酵罐内的液体的PH值并释放产出的气体。发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况，当活菌总数达到20亿/ml的浓度和PH值达到3. O 4. O时停止发酵。乳酸菌的发酵培养基的成分为豆柏粉3g、大豆粉lg、硫酸按0. 3g、玉米淀粉2g、糖蜜log、磷酸二氢钾0. 2g、磷酸二氢钠0. 3g、磷酸镁0. 2g以及水83g。(7)将上述放线菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和乳酸菌的菌液仍按放线菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢杆菌30g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g的比例混合，得到复合菌液。
步骤二海藻发酵生物饲料的制备海藻固体发酵培养基的制备海藻粉碎，过20 60目筛，灭菌，冷却待用。(I)将复合菌液按重量比1:25的比例接入121°C、30min高温灭菌的海藻固体发酵培养基中，在海藻固体发酵培养基中添加植酸质O. 2%为产物促进剂，搅拌35min至均匀，倒入50 70kg消毒双层饲料袋中密封发酵，温度30 35°C，时间8天。(2)发酵过程中取样三次，测定水分和PH值，发酵结束后取样，测定水分为35 40%、PH 值为 4. 5 6. O ;步骤三干燥、粉碎和包装(I)干燥将步骤二的发酵产物放入培养箱干燥，温度控制在40°C，时间15小时，干燥完成的物料水份控制在12% ；(2)粉碎转入粉碎机进行粉碎·，物料温度控制在45°C以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎；(3)筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放取样检测，主要参数水份12%、活菌数20 30亿/g、总蛋白量16% ;物理性状浅绿色粉末状固体。(4)计量打包①选用塑料模密闭包装；②每包重量为25kg。实施例二步骤一生产菌种的制作将筛选的放线菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35°C温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2 6°C的冰箱中进行保存；营养琼脂培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g, NaCl 5g，琼脂15 20g、水1000ml, PH7. O 7. 2。121。。灭菌 20min。淀粉培养基蛋白胨10g、NaC15g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水、琼脂15 20g, 121°C灭菌 20min。有益菌株的液体培养(I)按以下重量百分比称取各菌种放线菌15g、枯草芽孢杆菌45g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g。( 2 )放线菌的液体培养同实施例一(3)枯草芽孢杆菌的液体培养将称取的枯草芽孢杆菌的菌种按重量比1:30的比例接种于123°C、45min高温灭菌的液体培养基中发酵，发酵时通气量维持在1:1，发酵时间28h，待PH值上升到7. 5时停止发酵。枯草芽孢杆菌的发酵培养基的成分为豆柏粉2g、大豆粉3g、硫酸铵O. 7g、玉米淀粉5g、糖蜜148，磷酸二氢钾0.88，磷酸二氢钠28、硫酸镁^、无菌水67.58。其中，枯草芽孢杆菌的发酵培养基中加入O. 2%吐温为产物促进剂。(4)干酪乳杆菌的液体培养同实施例一(5)乳酸菌的液体培养
本实施例中选择植物乳杆菌和干酪乳杆菌进行乳酸菌的液体培养。将称取的植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合在一起进行复合培养。将混合菌苔按重量比按1:30的比例接种于123°C、45min高温灭菌的乳酸菌的发酵培养基中，接种后液体在发酵罐中搅拌30min，发酵罐的转速为220r/min，搅拌均匀后放入消毒后的塑料桶中静置5 7天，静置过程中每天测定发酵罐内的液体的PH值并释放产出的气体。发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况，当活菌总数达到20亿/ml的浓度和PH值达到3. O 4. O时停止发酵。乳酸菌的发酵培养基的成分为豆柏粉6g、大豆粉3g、硫酸钱O. Sg、玉米淀粉5g、糖蜜15g、磷酸二氢钾Ig,磷酸二氢钠1. 8g、硫酸镁Ig以及无菌水66. 4g。(7)将上述放线菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和乳酸菌的菌液仍按放线菌15g、枯草芽孢杆菌45g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g的比例混合，得到复合菌液。步骤二海藻固体发酵培养基的制备海藻粉碎，过20 60目筛，灭菌，冷却待用。(I)将复合菌液按重量比1:30的比例接入123°C、45min高温灭菌的海藻固体发酵培养基中，在海藻固体发酵培养基中添加植酸质O. 2%为产物促进剂，搅拌35min至均匀，倒入50 70kg消毒双层饲料袋中密封发酵，温度30 35°C，时间8天；(2)同实施例一；步骤三干燥、粉碎和包装(I)干燥将步骤4发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在40°C，时间15小时，干燥完成的物料水份控制在12% ；(2)粉碎转入粉碎机进行粉碎，物料温度控制在45°C以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎；(3)筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放取样检测，主要参数水份12%、活菌数20 30亿/g、总蛋白量16% :物理性状浅绿色粉末状固体。(5)计量打包①选用塑料模密闭包装；②每包重量为25kg。本发明采用正交试验确定了放线菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌等菌的复合菌液发酵海藻的最优培养基，通过单因素试验优化了多菌种混合发酵海藻的培养条件与固态发酵方法。上述实施例一和实施例二分别对应发酵I号和发酵2号。发酵I号所采用的菌种为放线菌15g、酵母菌15g、枯草芽孢杆菌30g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g ;发酵2号所采用的菌种为放线菌15g、枯草芽孢杆菌45g、干酪乳杆菌20g、乳酸菌20g。试验结果表明，海藻发酵后，氨基酸成分分析结果表明发酵I号与发酵2号的发酵产物比发酵前的海藻的蛋氨酸(Met)含量分别提高了 12. 21%与5. 11% ;亮氨酸(Leu)分别提高了 7. 67%与3. 75% ；谷氨酸(Glu)含量分别提高了 12. 21%和1. 112%;其次脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)等均有所提高，改善了海藻的品质。实施例三本实施例研究樱桃谷肉鸭日粮中添加不同水平的海藻发酵生物饲料对其生长性能的影响。选取360只I日龄健康樱桃谷肉公鸭，共设6个处理，每个处理3个重复，每个重复20只鸭，试验分为前期(I 21d)和后期(22 42d)两个阶段。6个处理分别对应6个组，第I组为对照组，饲喂基础日粮，第I1、m、iv、V、νι组为试验组，其添加水平分别为2%、4%、6%、8%、10%。自由采食和饮水。当肉鸭日粮中添加剂量为4%和6%时，全期(I 42日龄)日增重显著高于对照组和其他试验组(P〈0. 05)，料肉比显著低于对照组(P〈0. 05)。海藻发酵生物饲料对樱桃谷肉鸭具有促生长作用，在日粮中的适宜添加剂量为4% 6%。本实施例中的海藻发酵生物饲料选择上述实施例一制备的海藻发酵生物饲料。本实施例实验研究发现，海藻经过发酵后，其所含有的胶质包被破坏，营养物质更易吸收，而且纤维素含量降低也有利于肉鸭消化吸收。在全期(I 42日龄)，饲料中添加海藻发酵生物饲料的为4% 6%时，效果最明显，体重增加、日增重显著高于对照组及其他试验组(P〈0. 05)，采食量也高于对照组及其他试验组，料肉比则低于对照组及其他试验组。这与之前的在肉鸡、蛋鸡、肉猪上的应用研究结果基本吻合。试验中还发现，日增重和采食量在I 22日龄时，各实验组与对照组差异显著(P〈0. 05)，而在22 42日龄时，各实验组与对照组差异不显著(P>0. 05)，这说明海藻发酵生物饲料对鸭的促生长作用主要表现生长前期，在后期的影响有限。根据本实验的结果表明，海藻发酵生物饲料在日粮中的适宜添加剂量为4 6%ο实施例四本实施例选用三元杂交(杜X长X大)生长育肥猪180头，随机分成4个处理，每个处理3个重复，每个重复15头猪。4个处理为对照组、抗生素组、试验I组和试验II组，分别饲喂玉米一豆柏型日粮不含抗生素、玉米一豆柏型日粮添加抗生素、海藻发酵生物饲料不发酵组、海藻发酵生物饲料24h组。试验结束时前腔静脉采血，测定血清生化指标，试验期28d。试验结果表明①在生长性能方面，试验II组与对照组和试验I组相比，平均日增重分别提高了 47. 50%和37. 21%,料肉比分别降低了 21. 38%和16. 88% (Ρ〈0· 05)。②试验II组分别与对照组、抗生素组和试验I组相比，血清碱性磷酸酶活性分别提高了 15. 88%、12. 48%和9. 16% (Ρ〈0· 05)，丙氨酸转氨酶活性分别提高了 6. 45%,5. 25%和5. 96%。本实施例中的海藻发酵生物饲料选择上 述实施例二制备的海藻发酵生物饲料。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
权利要求
1.一种海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一、使用按重量计15 25份放线菌、15 25份酵母菌、30 45份枯草芽孢杆菌、20 35份干酪乳杆菌和20 35份乳酸菌中的两种或两种以上制备复合菌剂；步骤二、使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻。
2.如权利要求1所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，所述复合菌剂的制备过程包括以下步骤(1)按照所述步骤一的重量比分别称取所选择的菌种，并对各菌种单独进行培养；(2)按照与所述步骤(I)的比例，将单独培养得到的各菌液混合。
3.如权利要求2所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，使用所述步骤一制备的复合菌剂发酵海藻，通过以下过程实现将海藻制备成海藻固体发酵培养基，将复合菌剂按1:25 30的比例接种于海藻固体发酵培养基中发酵，发酵温度为30 35°C，发酵时间为8 10天。
4.如权利要求3所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，将复合菌剂接种于海藻固体发酵培养基中，还向海藻固体发酵培养基中添加O. 05% O. 2%的植酸质。
5.如权利要求3所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，复合菌剂发酵海藻固体发酵培养基的发酵产物的pH值为4. 5^6. O,水分的质量含量为40%。
6.如权利要求5所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，还包括步骤三、将所述步骤二的发酵产物干燥，干燥温度为4(T45°C，干燥时间为14 16h，干燥完成后发酵产物的水分在12%以下。
7.如权利要求2所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，放线菌的培养方法为将放线菌的菌种培养成种子液，将种子液接种于放线菌发酵培养基中进行第一次发酵，第一次发酵条件为在25 30°C下振荡培养5天，将第一次发酵的发酵液再接种于放线菌发酵培养基内进行第二次发酵。
8.如权利要求2所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，枯草芽孢杆菌的培养方法为将枯草芽孢杆菌的菌种接种于枯草芽孢杆菌的发酵培养基中发酵，其中，枯草芽孢杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂，干酪乳杆菌的培养方法为将干酪乳杆菌的菌种接种于干酪乳杆菌的发酵培养基中发酵，其中，干酪乳杆菌的发酵培养基中添加有产物促进剂。
9.如权利要求2所述的海藻发酵生物饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，乳酸菌的培养方法为将乳酸菌的菌种接种于乳酸菌的发酵培养基中发酵，当检测到乳酸菌的发酵培养基内的活菌总数达到20亿/ml，且乳酸菌的发酵培养基内的液体的pH值达到3^4时停止发酵。
全文摘要
本发明涉及一种海藻发酵生物饲料制备方法。本发明采用放线菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和乳酸菌制备复合菌剂，对海藻进行发酵，利用多种菌种之间的协同作用，在产生大量的纤维素酶类降解纤维的同时，充分利用无机氮源和有机氮源以及纤维分解产生的糖类合成菌体蛋白，本发明的海藻发酵生物饲料比海藻具有含量更高的必需氨基酸，营养价值更高，动物吸收快，日增重可提高47%，免疫力增强，血清碱性磷酸酶活性提高15%，丙氨酸转氨酶活性提高6%，养殖效果作用更明显。且本发明的制备方法相比现有技术还具有生产成本低、周期短的特点。
文档编号A23K1/14GK103039696SQ20121044086
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者方希修, 王权, 王冬梅, 方圆 申请人:方希修