专利名称：利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺及产品的利记博彩app
利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺及产品技术领域：
本发明提供利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺及产品，属于农业集约化生产技术，该生物有机肥富含大量促进作物生长的功能菌，同时含有游离氨基酸，能够显著促进农作物生长。二、背景技术
近年来，国内外各大湖泊相继出现蓝藻水华暴发现象，湖泊富营养化问题日益得到人们的关注。打捞蓝藻法是目前非常有效的和学术界没有争议的一种方法。由于捞藻含水量较大，达到88%，占地较多，蓝藻作为一种生物质资源，探索其资源化利用较有意义。蓝藻水华中含有植物蛋白、多糖等丰富营养成分，将这些资源进行转化，将可能实现太湖蓝藻废弃资源利用，减少捞藻的二次污染，使其变废为宝，化害为利。但原料蓝藻里含毒素、蛋白等大分子物质，不经过处理会二次污染环境(氮、磷、藻毒素)，而且养分不能直接被植物所利用(杜静，《太湖水华蓝藻资源化技术研究》D，南京农业大学，2008，硕士学位论文；韩志国，武宝王，郑解生，等.淡水水体中的蓝藻毒素研究进展(综述KJ].暨南大学学报自然科学版，2001，22 (3) 129-134 ;杨海麟，李克朗，张玲，等.蓝藻资源无害化利用技术的研究[J].生物技术，2008，18 (6) :95-98)。因此，需要进行开发利用。
随着我国饲养业的不断发展，废弃的家禽羽毛越来越多，初步统计年产量已达70 多万吨，且没有被合理地加工利用，作为丰富的蛋白资源被白白浪费，同时也造成了严重的环境污染，因此，对废弃羽毛的高效加工利用势在必行。采用新型羽毛膨化机膨化羽毛法生产氨基酸，具有工艺简单，操作方便，使用安全，生产成本低，无环境污染等特点。该技术使羽毛角质蛋白中的二硫键和肽氢键彻底裂解，蛋白质的四级结构处于松散断裂状态，使膨化羽毛粉得到了熟化和灭菌。
打捞藻泥的含水量在86-89%之间，藻泥干物质全N含量为7. 5-8. 5%，全P含量为O. 44%，全K含量为0.5% ;有机质含量大于70%。(I、沈银武，刘永定，吴国樵，等.富营养化湖泊滇池水华蓝藻的机械清除[J].水生生物学报，2004，25 (2) :131-136. 2、蓝藻快速好氧堆肥的研究江南大学硕士论文2009第2页)。本专利从太湖打捞藻泥和废弃羽毛膨化粉富含的丰富蛋白、多糖出发，利用该类资源与普通腐熟牛粪堆肥二次固体发酵根际促生芽孢杆菌，研发出了作物促生生物有机肥。
生物有机肥的本质特征是含有特定功能的、表现出一定肥料效应的微生物，这些功能微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素。生物有机肥发挥作用的关键在于肥料中有益微生物的数量，因此研究不同的配方和二次固体发酵工艺确保肥料中活菌数达到最高变得尤为重要。目前提高生物有机肥中功能微生物数量，常用的方法是在二次固体发酵过程中加入大量的外源氨基酸。该类氨基酸的种类很多，如菜饼、豆饼等，但此类氨基酸成本很高，尤其是豆饼。探求和开发出新型低成本氨基酸，大幅度降低生物有机肥的成本，变得意义尤为重大。三、发明内容
技术问题本发明目的在于针对生物有机肥生产成本昂贵和功能菌数量得不到保障的问题，开发出一种利用藻泥、废弃羽毛粉为生物有机肥配方中的氨基酸原料，研制出富含功能微生物和游离氨基酸的促生生物有机肥的配方和工艺。
技术方案
所用菌株为根际促生芽孢杆菌SQR9，分离自黄瓜根际土壤，该菌株革兰氏染色为阳性，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 5808。鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。SQR9菌株在培养温度为30°C，初始pH为7. O 8. 0，碳源为葡萄糖或蔗糖，氮源为蛋白胨或酵母膏时可达到最大的生长量。幼龄培养物形态均为杆状、具有运动性，产芽孢、芽孢形状呈椭圆形，孢囊膨大， 菌落不规则、干燥、不透明。
利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺，包括
I)将促生菌SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为 PH生长范围自然，培养温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> IXlO9个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制 IL培养基为例用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值调至7. 0-7. 6，121°C灭菌20min。
2)将质量比为5%藻泥(干重)、10%废弃羽毛膨化粉、10%菜饼和75%的腐熟牛粪堆肥进行均匀混合；
3)将SQR9促生菌液接种入藻泥、废弃羽毛膨化粉、菜饼和腐熟后的牛粪堆肥混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I 次，使固体发酵温度不超过50°C，发酵6-7天后结束，促生菌含量可达到2 X 108CFU/g (肥料干重)以上，最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下， 包装出厂即为成品促生生物有机肥。所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量质量比为25-30%。
用上述配方工艺生产的促生生物有机肥中有益活菌数> 2X108CFU/g(肥料干重)，全氮含量为2-3%，总氮磷钾养分为6-8%、有机质含量>45%。该产品中微囊藻毒素 LR和RR的含量均低于4ug/kg。
有益效果本发明提供一种利用三种废弃蛋白质与腐熟牛粪研制促生生物有机肥的配方和工艺。
使用该发明生产的促生生物有机肥具有富含功能微生物和游离氨基酸，促生效果好的优点，适合蔬菜、果树等经济作物种植区域大面积使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。
产品与目前市场上的产品相比具有如下优点
I)本专利太湖打捞藻泥、废弃羽毛膨化粉、少量菜饼和腐熟牛粪普通肥作为配方， 二次固体发酵根际促生Bacillus amyloliquefaciens SQR9,研制出了成本较低的促生生物有机肥，该配方及工艺能够大幅度降低生物有机肥的成本，同时通过微生物的作用，蓝藻里的大分子藻蛋白能够被分解成小分子的氨基酸，可供植物直接利用，藻毒素能够被大幅度降低，生产的产品具有很强的市场竞争力。
2)操泥中蛋白含量可闻达50%以上,废弃羽毛粉蛋白含量可闻达85%以上,_■者氨基酸组份比较齐全，含有丰富的可溶性有机碳氮和种类齐全的氨基酸，能给功能菌提供十分优越的生长环境，研制而成的生物有机肥中高效菌株的含量大于2X108CFU/g(肥料干重)以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来，极大地提高了促生菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。
3)采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR的含量，结果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg (肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和 RR的含量分别为3. lmg/kg (藻泥鲜重)和62. 16mg/kg (藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg (肥料干重)以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于lug/kg。
4)同时肥料中丰富的氨基酸资源能够促进作物生长，试验结果表明，在蔬菜苗期上施用本产品后，能显著促进作物的生长。四
图I不同原料配方固体发酵促生菌的数量
图2促生专用生物有机肥配方固体发酵促生菌的数量
图3促生专用生物有机肥游离氨基酸的含量
图4黄瓜促生图
图5茄子促生图
生物保藏
根际促生芽孢杆菌SQR9，2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 5808。分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。五具体实施方式
I、藻泥的提供和废弃羽毛粉的生产
将屠宰场及菜场等的废弃羽毛收回，自来水冲洗，脱水机脱水，晒干至含水量低于 30%，进入自动喂料膨化机进行膨化，再进入粉碎机粉碎得到羽毛粉(自动喂料膨化机购自石家庄华隆科技有限公司)。
藻泥由太湖周边打捞站免费提供，放置藻泥储存池2个月。
2、功能菌菌剂的生产
将促生菌SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为pH 生长范围自然，培养温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> I X IO9个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制IL 培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加 20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值调至7. 0-7. 6，121°C灭菌20min。
3、固体发酵生成生物有机肥
3. I固体发酵配方的获得
利用递进法获得固体发酵的配方，首先将藻泥以不同梯度加入腐熟牛粪堆肥中， 进行固体发酵，获得最佳藻泥添加量，再在此基础上加入菜饼获得菜饼的最佳添加量，最后加入羽毛粉，获得最终配方。发酵方式如下每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次，使固体发酵温度不超过50°C，发酵7天后结束。发酵完后测定各处理中的功能菌的数量，结果如图，5%藻泥(干重)、10%废弃羽毛膨化粉、10%菜饼和 75%的腐熟牛粪堆肥为最佳配方，功能菌数量达到2父10*^^^(干重)以上。
3. 2固体大堆发酵生成成品有机肥
根据上述配方和工艺，将5%藻泥(干重)、10%废弃羽毛膨化粉、10%菜饼和75% 的腐熟牛粪堆肥进行均匀混合，将促生菌SQR9接入混合堆，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L进行固体发酵，每天翻堆I次，使固体发酵温度不超过50°C，发酵7天后结束；设计牛粪腐熟有机肥作为对照。发酵结束后新型生物有机肥中促生菌数量达到7. 9 X IO8CFU/ g (干重)(图2)，超过牛粪腐熟有机肥约2个数量级。所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，含水量质量比25-30%。研制成的低成本促生生物有机肥含有2X108CFU/g (干重)以上的促生菌SQR- 9、全氮含量为2-3% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6-8%、有机质含量大于45%。以上结果表明所研制配方和工艺完全能够最大化的发酵生产新型生物有机肥，且该生物有机肥完全能够符合国家标准。再进行残留藻毒素的检测，方法如下向IOOg肥料中加入100mL5%的乙酸，在-70和常温下反复冻融多次后，12000r/min离心lOmin，分别取出上清液(I)和沉淀；将沉淀用100mL80% 甲醇溶液震荡提取4h，离心15min，得上清液(II);将上清液(I)与上清液(II)充分混合后得上清液(III)，将上清液(III)用稀盐酸将pH调至3，静置过夜后离心，弃残渣，得上清液(IV)，将上清液(IV)用稀氨水将pH调至7后，40°C旋转蒸发去除甲醇，将剩余样品过O. 45 μ m滤膜得藻毒素粗提液。依次用20mL100%甲醇、20mL超纯水活化C18固相萃取柱(500mg/6ml)，将藻毒素粗提液通过固相萃取柱进行富集浓缩，再分别用20mL10%以及 20ml20%甲醇溶液淋洗固定相，最后用10mL80%甲醇溶液(加入O. 05%三氟乙酸)将吸附在固定相上的微囊藻毒素洗脱下来，将纯化后的微囊藻毒素通过旋转蒸发除去甲醇得MCs 储备液，将储备液冷冻干燥后，用20%甲醇定容到2ml，液体供HPLC上机检测。
采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR的含量，结果表明微囊藻毒素 LR和RR的含量均低于4ug/kg (肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和RR 的含量分别为3. lmg/kg (藻泥鲜重)和62. 16mg/kg (藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR(microcystin-LR)和RR(microcystin-RR)的含量降低到4ug/kg (肥料干重)以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于lug/kg。
3. 3生物有机肥中的氨基酸含量和成分
利用茚三酮比色法测定所研制的生物有机肥中游离氨基酸的含量，结果见图3，发酵完成后，新型促生生物有机肥(BIOW)中游离氨基酸的含量(22. 03g/kg)远远超过对照牛粪(OF)的含量(O. 32g/kg)。
4、温室促生试验
4. I促生有机肥在黄瓜上的盆栽效果
共设两个对照一个处理，处理添加本专利研制的新型促生生物有机肥(BLOW)，对照分别添加普通牛粪有机肥(CK)和本实验室专利产品(BI0，专利号ZL200910183358. 1)。 每个处理12盆，每盆装10kg 土，肥料的添加量为2%。肥料与土充分混合均匀，常规管理。 定期测定黄瓜生长指数。结果如图4、表一、表二、表三、表四和表五，与普通有机肥对照相 t匕，促生生物有机肥的施用能够显著增加黄瓜植株的株高、茎粗、叶绿素含量和地上部和地 下部鲜重，30天时地上部干重差异显著，40天时地下部干重差异显著。与黄瓜专用BI0有 机肥相比，40天时，株高和茎粗达到显著性差异；50天时茎粗差异不显著；叶绿素含量、地 上部鲜重和干重和地下部鲜重和干重无显著性差异。
表一不同有机肥对黄瓜株高的影响单位cm
权利要求
1.利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺，包括 1)将保藏号为CGMCCNO. 5808的根际促生解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产,发酵生产的条件为培养温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量> I X IO9个/ml ;所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml, pH值调至7. 0-7. 6，121°C灭菌20min ； 2)将质量比为5%藻泥干重、10%废弃羽毛膨化粉、10%菜饼和75%的腐熟牛粪堆肥进行均匀混合； 3)将促生菌SQR9发酵液接种入藻泥、废弃羽毛膨化粉、菜饼和腐熟后的牛粪堆肥混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次，使固体发酵温度不超过50°C，发酵6-7天后结束，促生菌含量可达到2 X 108CFU/g肥料干重以上，最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为成品促生生物有机肥；所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量质量比为25-30%。
2.权利要求I所述工艺生产的促生有机肥产品，该产品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。
3.根据权利要求I所述的促生生物有机肥产品，其特征在于，该产品中促生菌SQR9活菌数> 2X108CFU/g肥料干重，全氮含量为2-3%，总氮磷钾养分为6-8%、有机质含量≥ 45%。
4.权利要求2和3所述促生生物有机肥产品在促进农作物生长方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种利用三种废弃蛋白与腐熟牛粪生产促生生物有机肥的工艺及产品，属于农业集约化生产技术。所用配方为75％腐熟牛粪普通肥(干重下同)、5％藻泥、10％废弃羽毛膨化粉和10％菜粕；所用菌株为促生解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens SQR-9；工艺流程为将原料以上述最优配方混合，5％接入促生菌，条垛式发酵，每天翻抛1次，发酵6-7天。所生产的肥料有益活菌数大于2×108CFU/g(肥料干重，下同)，全氮含量为2-3％，总氮磷钾养分为6-8％、有机质含量超过45％，微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。富含有益氨基酸，生产成本低、促生效果好、可应用于粮食作物、蔬菜等。
文档编号C05F15/00GK102924141SQ201210436080
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者沈其荣, 李 荣, 张苗, 曹亮亮, 施娟娟, 黄炎, 杨兴明 申请人:南京农业大学, 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司