专利名称：一种与amf协同抗病促生的拮抗菌及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体说，本发明涉及一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌及其在防治蔬菜土传病害中的应用技术领域。
背景技术：
在新疆由于其独特的地理及气候条件，设施农业成为蔬菜种植的主要模式之一， 并且随着国家及自治区对菜篮子工程的重视，设施农业的发展速度及规模逐年提高和扩大，但由于设施农业病虫害易发、难控制的现实情况，因此对于病虫害的防控也提出了更高的要求，尤其是设施农业中的蔬菜病害尤为严重，而土传病害是防控的主要目标之一；土传病害是指生活在土壤中的病原体或者土壤中病株残体中的病菌，从作物根部或茎部侵害而引起的病害；设施农业蔬菜土传病害主要有蔬菜根结线虫病、瓜类枯萎病、黄萎病、苗期的立枯、猝倒病等；设施农业蔬菜栽培，由于受地理条件限制，轮作倒茬困难，连作周期长，加上温度、湿度等条件有利于各种病害的发生、传播，土传病害防治难度较大，近年来，其发病率高、危害性大，已成为影响设施农业蔬菜生产效益的主要障碍因素，严重制约着蔬菜产业的发展;AM真菌丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal简称AMF, AM真菌，旧称 VA菌)普遍存在于世界各地的土壤中，其宿主包括苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物；据统计，地球上90%的维管植物和农业生态系统中大多数作物都能形成丛枝菌根；丛枝菌根真菌与植物共生可以增加植物根部的吸收面积，增加对矿质营养特别是对磷素的吸收，因此能促进植物地上部和根部的吸收，同时还能提高植物的抗逆性；针对单个AMF对于作物的生长、病害的防治，AM真菌与PGPR相互作用的效应与机制等的报道、研究较多，但是能与AM真菌协同抗病促生的拮抗菌还未见公开报道。发明内容
针对现有技术中针对与AMF协同抗病促生的拮抗菌的未有报道及防控土传病害拮抗菌的研究的现状，本发明旨在提供一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌 {Bacillus amyloliquefaciens)及其作为防治蔬菜土传病害拮抗菌中的应用，通过试验验证，采用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌{Bacillus具有拮抗作用的细菌对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病的解决具有突出的技术效果，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌具有广泛而适用的价值。
本发明采用主要的技术方案通过在新疆阜康郊区多年种植的农田中采取土壤样品进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得一株编号为S-13。通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌S-13的发酵液的抑菌率、稳定性等特性进行了深入研究，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌提供了新的选择，其拮抗作用对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解决具有突出的技术效果。
本发明具体提供的一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌(Macillus amyloli quefaci ens ),通过在新疆阜康郊区多年种植的农田土壤中分离、筛选和培养，获得一批作为防治蔬菜土传病害的微生物菌株，从中筛选出一株编号为S-13的菌株，防治蔬菜土传病害具有稳定而显著的效果，经微生物学分类与鉴定，属于解淀粉芽孢杆菌 amyloliquefaciens)。
具体的，本发明提供的一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌 {Bacillus amyloliquefaciens'),命名为S_13。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址 北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2012年9月3日，保藏号是CGMCC No. 6491。经微生物学鉴定为芽孢杆菌UaciJAz1S amyloliquefaciens\该菌株最适生长条件为温度32° C，培养基为固体LB,培养条件pH 7.0-7. 2，时间14-16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皱，边缘不整齐，不透明；显微观察其菌体呈短杆状，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(iBergey, s Manual of Sys tema tic Bac terio -logy)))和《常用细菌系统鉴定手册》对S-13菌株进行形态学测定，生理生化检测确定S-13菌株为芽孢杆菌{Bacillus中的成员。通过BLAST同源比对,菌株S_13的16S rRNA序列在NCBI 数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，参见附图2所示，菌株S-13与Bacillus amyloli quefaci ens⑶323369. I处于最小分支，是其近似种；菌株16S rRNA序列提交至GeneBmk中获得基因登录号为JN676212。因而将菌株S-13确定为解淀粉芽孢杆菌 (.Baci Ilus amyloli quefaci ens )。
进一步，本发明提供与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌S-13 {Bacillus amyloli quefaci ens )作为防治蔬菜土传病害的应用。
同时，本发明证明，提供的与AMF协同抗病促生的拮抗菌芽孢杆菌S-UiMcillus amyloli quefaci ens )作为番爺枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病拮抗菌的应用，具有良好的拮抗能力、广谱拮抗作用。
本发明进一步提供了菌种的保存条件，采用培养基成分蛋白胨1%(W/V)，酵母膏O.5% (W/V)，氯化钠 1% (W/V)，琼脂 2% (W/V)，pH 7. 0-7.2,121° C 灭菌 20 分钟。培养条件在其LB培养基斜面上32° C条件下，培养14-16小时，后采用无菌的脱脂牛奶为保护剂，真空冷冻干燥后低温保存；平时使用保存在LB培养基的斜面上，4° C冰箱保存备用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。
(I)本发明提供了分离得到的芽孢杆菌CGMCC No. 6491，是一种解淀粉芽孢杆菌，作为防治蔬菜土传病害的应用具有较高的价值，尤其是能够针对本地生境分离出的适应本地气候及生长环境的拮抗菌对于提高作物产量，减少农药使用量，构建良好的生态环境具有积极作用。
(2)本发明针对设施农业中几种常见的蔬菜病害筛选出一株具有较好拮抗能力、 广谱拮抗作用的芽孢杆菌CGMCC No. 6491，经过16S rRNA序列扩增、比对、进化树的建立初步鉴定为芽抱杆菌属，ifeciJJiAs amyloli quefaci ens⑶323369. I的近似种。拮抗菌S-13具有广谱抗真菌活性，能够抑制番茄枯萎病原菌、辣椒疫霉病病原菌、辣椒炭疽病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌等真菌，在平板对峙培养条件下表现良好，对于病原菌菌丝的生长具有明显的抑制作用，并且拮抗菌S-13经过抗生素诱导后的定殖研究表明，S-13能够在植株的根部土壤、根、茎、叶等不同部位都有定殖，是一株优良的拮抗菌株。同时为了能在今后方便、 高效的利用，优化了其发酵培养基及发酵工艺，使芽孢率与产量得到大幅提高，对于产业化发展具有积极作用。该菌种芽孢杆菌S-13与AMF作为协同抗病促生的拮抗菌，具有良好的效果，作为防治蔬菜土传病害的应用具有潜在的应用价值，特别是作为番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病的应用，具有良好的拮抗能力、广谱拮抗作用。
图I 显不为解淀粉芽抱杆菌 Cfeci77w5· amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491 的菌落形态图。
图2 显不为解淀粉芽抱杆菌 Cfeci77w5· amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491 的生长曲线图。
图3 显不为解淀粉芽抱杆菌amyloli quefaci ens )CGMCC No. 6491—的 16S rRNA系统发育树图。
图4显示为黄瓜枯萎病发病率统计结果图。
图5显示为平板对峙培养与番茄育苗实验图。
图6显示为番茄发病率统计结果图。
图7显示为辣椒疫霉病植株死亡率统计结果图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备本发明采用的植物病原菌番爺枯萎病菌株黄瓜枯萎病原菌 iFusarium oxysporium f. sp. cucumerinum)、敕椒良霉病盾、舊 iPhytophthora cap-sici Leonian )都由ACCC (中国农业微生物菌种保藏中心)提供，本发明选用的AM真菌，本领域技术人员都可以通过公众渠道获得。
培养基及其它材料培养基选用LB固体、液体培养基；作物种子采用番茄、黄瓜、辣椒作为蔬菜类中代表性试验种类。
主要仪器与试剂MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，Sff-CJ-IF B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-IOOt5PCR仪Eppendorf No:5345,电泳仪 Bio-Rad Mode 200/2. 0，凝胶成像仪 United-Bio, GK-330C plus, PCR 预混液{TaKaRa Biotechnology),其余试剂均为分析纯。
本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一解淀粉芽抱杆菌Cfeci77w5· amyloli quefaci ens )CGMCC No. 6491 的分离、筛选及鉴定(I)拮抗菌的分离和筛选从农田土样中通过梯度稀释法分离出多株细菌，采用平板对峙法，根据有无抑菌圈判断其是否具有拮抗作用，初步筛选出对番茄枯萎病原菌、黄瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌具有一定拮抗能力的菌株。对具有拮抗作用的菌株进行二次对峙实验，筛选出拮抗能力较强的囷株以备后续实验。
复筛获得一株具有良好拮抗番茄枯萎病原菌、黄瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌作用的细菌分离物，命名为S-13，培养72小时其能够明显的抑制病原菌菌丝的生长，经多次实验验证其抑菌效果较为稳定。
参见附图1，获得的S-13菌在培养基培养，该菌株最适生长条件为温度32 ° C，培养基为LB固体培养基，培养条件pH7. O,温度32° C条件下培养14_16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皱，边缘不整齐，不透明；显微观察其菌体呈短杆状，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《汝'/ 1 % 5 Manual of Systematic ifecierio-yo#》)和《常用细菌系统鉴定手册》对S-13菌株进行形态学测定,生理生化检测确定S-13菌株为芽抱杆菌^Bacillus中的成员。通过上述对S-13菌株进行形态学测定，并对菌株S-13的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的S-13菌株生物学特性如表I所示。
(2) PCR扩增拮抗菌16S rRNA序列及其测序挑取少量单菌落，放入盛有25 μ L无菌水的EP管中，100° C煮沸8-10 min，后迅速放入冰水混合物中5 min。离心10000 r/min、5 min,4° C保存,用时取上清。PCR扩增16S rRNA序列。
引物I (27F) :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；引物 2 (1492R) 5/ -CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3'。
PCR扩增反应体系为50 μ L，含有24 μ L premix Taq,引物I I μ L，引物2 I μ L， 模板 2 μ L，无菌水 22 μ L。扩增条件94° C 4 min, 94° C 55 s，53° C 30 s，72° C 90 s，30个循环；72° C 7 min。扩增产物(约1500 bp)经1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR 产物直接进行双向测序。
(3) 16S rRNA序列比对及系统发育分析将测序得到的16S rRNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rRNA序列,用Clustal X软件和MEGA 4. INeighbor-joining法构建系统进化树，参见附图3。菌株16S rRNA序列提交利用GeneBank中的BankIt软件进行在线提交，获得基因登录号。
结合S-13的形态结构特征及生理生化特性，确定其为解淀粉芽孢杆菌OfeciJAz1S amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491。
将S-13的16S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树。 参见附图3所不，菌株S-13与amyloli quefaci ens GU323369. I之间进化距离 ^mBacillus amyloli quefaci ens的近似种。结合S_13的形态结构特征及生理生化特性，确定其为解淀粉芽孢杆菌iBacillus amyloliquefaciens\
表I :菌株S-13的生理生化特性
权利要求
1.一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌，其特征在于，拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌{Bacillus amyloliquefaciens^) CGMCC No. 6491。
2.如权利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌amyloliquefaciens)CGMCCNo. 6491作为防治蔬菜土传病害中的应用。
3.如权利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作为番茄枯萎病拮抗菌的应用。
4.如权利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作为黄瓜枯萎病拮抗菌的应用。
5.如权利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢杆菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作为辣椒疫霉病拮抗菌的应用。
全文摘要
本发明公开一种与AMF协同抗病促生的拮抗菌及其应用，该拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No. 6491。通过在新疆阜康郊区多年种植的农田中采取土壤样品进行拮抗菌的筛选，获得具有较强抑菌活性的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，并通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时对该细菌的发酵液的抑菌率、稳定性等特性进行了深入研究，作为防治蔬菜土传病害拮抗菌提供了新的选择，其拮抗作用对于番茄枯萎病、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解决具有突出的技术效果，具有广泛的应用价值。
文档编号A01P3/00GK102978128SQ20121043025
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者詹发强, 侯敏, 崔卫东, 杨蓉, 龙宣杞, 张慧涛, 侯新强 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所