专利名称：一种薄荷节间茎段高效再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种薄荷节间茎段高效再生的方法建立
背景技术：
薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)的莖、叶中富含挥发油,被广泛地应用于食品、医药、化妆品、香料、烟草等工业。薄荷全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等。薄荷是我国重要的香料和药用植物之一，在江苏、安徽、江西等地广为栽培，已成为当地重要的农业特种经济作物。但是在薄荷生产中出现的品种单一、品种退化现象，使薄荷的育种工作越来越引人注目。利用转基因技术培育薄荷优良新品种，具有目的基因来源广，可定向改变目标性状的优点。建立一种高效的组织培养再生系统并最终将其建立成转基因受体系统是获得转基因育种成功的关键。目前针对国内薄荷品种的快速繁殖系统主要以茎尖为再生材料，但该方法茎尖繁殖时间短适合于薄荷品种的大规模扩繁并不适用于遗传转化方法的建立。因此，为了便于更好的开展国内中药薄荷品种的遗传转化研究，必须建立一种完善的的中药薄荷主栽品种的遗传转化受体·系统。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种中药薄荷品种的高效再生遗传转化受体系统。本发明以国内薄荷栽培品种为对象，建立了高再生率、稳定、重复性好的遗传转化受体系统，为利用基因工程技术进行遗传育种奠定基础。对我国薄荷种质资源创新与改良等方面具有积极作用和现实意义具体内容I、本发明提供一种薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)莖段组织培养快繁新方法，按以下次序的几个步骤进行(I)外植体的采集和无菌体系的建立3 6月份采集薄荷顶芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水冲洗30min。接种前用75% (V/V)酒精消毒30s，再用0. 2% (m/V)HgC12溶液浸泡15min，无菌水冲洗3次。吸干表面水份后，剥去外层叶片，切成0. 5cm长的茎尖，接种在下列培养基中
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5- 2.0 mg-L'1
萘乙酸(NAA)0_1 0.3 mg.L-1
I
蔗糖25 35 g-L'1
琼脂5.0 6.0 g-L'1
pH5.6- 6.0在温度25±3°C，光照度1500 30001x，光照时间10 12h/d，培养25 45d后继代于相同培养基上30d后获得无菌苗材料。(2)、节间茎段不定芽诱导培养在无菌条件下，将无菌材料第2，3，4节间茎段接种到下列诱导培养基中。MS基本培养基
噻苯隆(TDZ)2.0-4.0 mg-L'1
吲哚乙酸(IAA)0.2- 0.5 mg-L'1
椰汁(CW)20%~25% mg-L'1·蔗糖25 35 g-L'1
琼脂5.0~ 6.0 g-L'1
pH5.6 6.0在温度25 ± 3°C，暗培养40 50d，节间茎段不定芽诱导率可达90 %以上。(3)、不定芽继代生长培养将步骤(2)获得的不定芽剪下，接种到下列培养基中。MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.5- 1.0 mg-L—1
萘乙酸(NAA)0.1~0.5mg.L-1
蔗糖25 35 g-L'1
琼脂5.0~ 6.0 g-L-1
pH5.6- 6.0在温度25±3°C，光照度1500 30001x，光照时间10 12h/d，培养30d;(4)、壮苗培养为进一步提高移栽成活率的在生根前需进行壮苗培养。将步骤
(3)获得的不定芽转入下列壮苗培养基中。MS基本培养液
6-节基氨基嘌呤(6-BA)0.5~1.0 mg-L"1
萘乙酸(NAA)0.3- O.Smg-L"1
蔗糖20~ 30 g-L'1
琼脂5_0 6.0 g-L'1
pH5.6- 6.0在温度25±3°C，光照度1000 20001x，光照时间10 12h/d。培养20 35d。(5)、生根培养将步骤(4)获得株高5. 0 8. Ocm的无菌苗，转入下列生根培养基中。1/2MS基本培养基
6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1 0.5 mg.!；1
萘乙酸(NAA)0.5 1.0 mg-L4
蔗糖20~ 30 g-L_1
琼脂5.0~ 6.0 g-L'1
pH5.6 6.0在温度25±3°C，光照度1000 20001x，光照时间10 12h/d。培养15 20d后，生根率可达90%以上，叶色浓绿，生长健壮。有益效果本发明通过节间茎段不定芽再生体系的成功构建，完成了外植体的选取、诱导分化、壮苗、生根等关键技术。这种再生体系不定芽诱导率可达95%，高效稳定、重复性好，不定芽再生周期短，适用于作为遗传转化的受体系统。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但实施例仅是示例性的，对本发明不构成任何限制。本领域的技术人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，而这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例一薄荷品种‘738’节间茎段不定芽再生，按以下次序的几个步骤进行I、外植体的采集和无菌体系的建立3 6月份采集薄荷顶芽，洗衣粉溶液浸泡15min后，流水冲洗30min。接种前用75% (V/V)酒精消毒30s，再用0.2% (m/V)HgC12溶液浸泡15min，无菌水冲洗3次。吸干表面水份后，剥去外层叶片，切成0. 5cm长的茎尖，接种在含I. Omg .L-1BA和0. 2mg .L-INAA的MS培养基中，培养基中含5. 6g L-I琼脂、30g L-I蔗糖，pH5. 5 5. 8，121°C灭菌20min。培养温度为25°C，光照时间8 10h，光照强度1500 20001x。培养三周后选健康无菌的植株接种于相同培养基中进行继代培养30d。2、节间茎段不定芽诱导培养选择经初代培养的无菌薄荷苗形态学第2，3，4位置不带节茎段作为诱导不定芽的材料。将鳞片下部接种到愈伤组织诱导培养基(MS+CW25%+TDZ3. Omg L-1+IAA0. 2mg L-I+ 蔗糖 25g/L+ 琼脂 5. 6g/L，pH5. 8)中进培养。培养温度25 ± 3°C，暗培养40d。不定芽分化率可达95 %以上。3、不定芽伸长培养将分化出的不定芽接种在含I. Omg -L^1BA和0. 2mg -U1MA的MS培养基中，培养基中含5. 6g .L—1琼脂、30g .L—1蔗糖，pH5. 5 5. 8，121。。灭菌20min。培养温度为25±3°C，光照时间8 10h，光照强度1500 20001x。
4、壮苗培养将步骤4所获得离体植株，转入壮苗培养基(MS+6-BA1. Omg I^+NAAO. 5mg I71+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 8g/L，pH5. 8)中进行培养。培养温度25±3°C，光照度15001x，光照时间12h/d。培养30d后，再生植株叶色浓绿，生长健壮。5、生根培养将步骤4所获得5 8cm小苗接种到生根培养基(MS+6-BA0. 2mg +NAAO. 5mg .171+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 8g/L，pH5. 8)中进行生根诱导。培养30d后生根率达95%以上，生根数5-10条。所有上述实验过程中所用到的试剂，均可购自Sigma和上海生工生物工程有限公
司。·
权利要求
1.一种薄荷节间茎段高效再生的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)外植体的选取与消毒取薄荷茎尖作为外植体，冲洗干净后，进行消毒； (2)节间茎段不定芽的诱导取步骤(I)中得到的无菌苗节间作为外植体，接种于不定芽诱导培养基中，培养温度25±3°C，暗培养40天；所述诱导培养基为MS基本培养基并添加激素TDZ、IAA ;所述诱导培养基中TDZ浓度为2. 0-4. Omg · L-I, IAA浓度为O.2-0. 5mg · L-I ； (3)不定芽继代生长将步骤(2)中诱导出的不定芽剪下接入不定芽继代生长培养基中培养30天，所述所述继代生长培养基为MS培养基并添加激素6-BA和NAA ;所述继代生长培养基中6-BA浓度为O. 5-1. Omg · L_\ NAA浓度为O. 1-0. 5mg · Γ1 ;所述正常培养条件为培养温度25±3°C，光照时间8-10h，光照强度1500-20001x ； (4)无菌苗的壮苗培养将步骤(3)中的到的无菌苗接种于壮苗培养基中培养20-35天，所述所述继代生长培养基为MS培养基并添加激素6-BA和NAA ;所述继代生长培养基中6-BA浓度为O. 5-1. Omg · L_\ NAA浓度为O. 3-0. 5mg · Γ1 ;所述正常培养条件为培养温度25±3°C，光照时间 8-10h，光照强度 1500-20001x ； (5)生根培养将步骤(4)获得的无菌苗接种于生根培养基中培养15-20天，所述生根培养基为1/2MS培养基并添加激素6-BA和NAA ;所述继代生长培养基中6-BA浓度为O.1-0. 5mg · L-1，NAA浓度为O. 5-1. Omg · L-1 ;所述正常培养条件为培养温度25±3°C，光照时间8-10h，光照强度1500-20001x ； 上述诱导培养基、继代培养基、壮苗培养基、生根培养基中均含有琼脂5. 5-7. Og/L、蔗糖 25-35g/L，且 pH 值为 5. 6-5. 8。
2.根据权利要求I所述薄荷节间茎段不定芽诱导方法，其特征在于所述步骤(2)中的节间外植体为(I)步骤所得无菌苗第2，3，4节节间茎段。
3.根据权利要求I所述薄荷节间茎段不定芽诱导方法，其特征在于所述步骤(2)中还含有椰汁，所述不定芽诱导培养基中椰汁浓度为20% -25%。
4.根据权利要求I所述薄荷节间茎段不定芽遇到方法，其特征在于所诉步骤(2)中的正常培养时间为40天；所述步骤(3)中继代生长培养时间为30天；所述步骤(4)中的壮苗生长时间为20-35天；所述步骤(5)中生根培养时间为15-20天。
5.根据权利要求I至3任一所述薄荷不节间茎段不定芽诱导方法，其特征在于所述步骤(I)中茎尖外植体取材于3 6月份；所述步骤(I)中进行消毒的过程为将外植体用洗衣粉溶液浸泡15分钟后，流水冲洗20-30min。于无菌操作台上75%乙醇消毒30秒，再用O. 2% HgCl2溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗3次。
所述节间茎段材料为无菌苗形态学第2，3，4节间茎段。
所述不定芽诱导培养基为MS基本培养基。
所述一定浓度的植物激素为TDZ2. O 4. Omg · Γ1和ΙΑΑ0. 2 O. 5mg · L' 所述添加剂为20% 25%椰汁。
将诱导40天后分化出的不定芽接种于芽伸长生长培养基上。所述壮苗培养基为MS基本培养基 +0. 5 I. Omg · L ^-BA+O. 3 I. Omg · L ^ΑΑ+δ. 5g · L 1 琼脂 +30g · L 1 鹿糖，pH5. 5 5. 8 ;培养条件为温度25°C，光照时间8 10h，光照强度1500 20001x ;培养20d，转接增殖2次；所述生根 培养基为 1/2MS+0. I O. 5mg · L ^-BA+O. 3 I. Omg · L ^ΑΑ+δ. 5g · L 1 的琼脂+30g吨―1蔗糖，pH5. 5 5. 8 ;培养条件为温度25°C，光照时间8 10h，光照强度1500 20001x ;培养 20d。
全文摘要
一种薄荷节间茎段高效再生体系的方法涉及薄荷节间茎段高效再生体系的方法，以薄荷无菌苗形太学第2，3，4节间茎段为材料，接种于不定芽诱导培养基上，经过诱导、伸长生长、继代增殖、壮苗、生根等关键技术的研究，最终建立了这种节间茎段再生的方法。本发明的优点是诱导不定芽再生率高达95％，并且稳定性好，操作简单，再生周期短，可用于作为农杆菌遗传转化的受体系统。
文档编号A01H4/00GK102783419SQ20121030182
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者于盱, 刘艳, 李维林, 梁呈元, 王海棠 申请人:江苏省中国科学院植物研究所