专利名称：用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法
技术领域：
本发明涉及一种用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法，属于棉花转基因育种技术领域。
背景技术：
目前棉花转基因植株的鉴定方法有多种，其中对带有II标记基因的转基因后代材料进行的筛选，主要是在苗期利用卡那霉素溶液(Kanamycin)点涂植株幼叶，以幼叶是否变黄来判断，为防止漏涂或涂抹不均匀而出现假阳性植株，需要在花铃期以前对材料涂抹2 3次，因此从大量的转基因材料中筛选出转基因植株，工作量很大、准确性较差。李俊兰(华北农学报，2003，18(2) : 118)曾报道用卡那霉素溶液通过浸种鉴定转基因种子，但她筛选时的浸种时间较短(8h)，需要用很高浓度的卡那霉素(5000-7500mg/ L) 溶液，其成本很高，并且附加O. 2%吐温的去离子水配制，也没有说明种子量与卡那霉素溶液的比例关系，其判断的指标为子叶加厚、叶色变深或子叶出现黄色斑块，表现为判断指标多、不单一，既有数量性状又有质量性状，掌握起来难度大、不易判断出阳性植株，对推广应用存在许多不利因素，并且通过浸种筛选以后，还要进行I 2次的用卡那霉素溶液点涂幼叶筛选，比较繁琐并没有完全摆脱用卡那霉素溶液点涂幼叶的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的缺点，而提供一种成本低廉、操作简单、过程标准化、准确可靠、容易掌握、出结果早的用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案
一种用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法，其特征在于步骤如
下
(1)浸种处理
取转化含有耶 - II标记基因的棉花种子，用浓度为1000-1500 mg/ 的卡那霉素溶液在24-26°C温度下浸种3d，所述卡那霉素溶液与棉花种子的比例为每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花种子；
(2)播种
将浸泡后的转基因棉花种子用自来水冲洗后播种到装有蛭石的纸桶中或直接播种到蛭石中；
(3)筛选转基因植株
当出苗3-5d后，根据棉花子叶上有无白化斑判断是否为转基因植株，将有白化斑的棉花苗即阴性植株拔除，棉花子叶上没有白化斑的绿苗即为阳性植株；
(4)分子鉴定对上述第(3)步中筛选的阳性植株再通过PCR检测进一步确认；
(5)移栽
将进一步确认后的阳性植株炼苗后移栽到田间。本发明的有益效果是成本较低、操作简单、过程标准化、准确可靠、容易掌握、出结果早。
图I为用卡那霉素溶液浸种处理的照片。图2为筛选阳性植株(箭头所示)和阴性植株的照片。图3为阳性植株炼苗移栽后照片。
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图4为筛选出的阳性植株的PCR检测图。图5为对部分筛选出的阳性植株southern blot检测图。在图5中，M为marker，CK+为质粒DNA，CK_为阴性对照，I 9为转基因材料。
具体实施例方式实施例I :
一种用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法，步骤如下
(1)浸种处理
取转化含有II标记基因的棉花种子，用浓度为1000 mg/ 的卡那霉素溶液在
24-26°C温度下浸种3d，所述卡那霉素溶液与棉花种子的比例为每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花种子；
(2)播种
将浸泡后的转基因棉花种子用自来水冲洗后播种到装有蛭石的纸桶中或直接播种到蛭石中；
(3)筛选转基因植株
当出苗3-5d后，根据棉花子叶上有无白化斑判断是否为转基因植株，将有白化斑的棉花苗即阴性植株拔除，棉花子叶上没有白化斑的绿苗即为阳性植株；
(4)分子鉴定
对上述第(3)步中筛选的阳性植株再通过PCR检测进一步确认；
(5)移栽
将进一步确认后的阳性植株炼苗后移栽到田间。实施例2:
实施例2与实施例I不同的是采用浓度为1500 mg/ 的卡那霉素溶液。实施例2的检测准确率达100%。
权利要求
1.一种用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法，其特征在于步骤如下 (1)浸种处理 取转化含有耶II标记基因的棉花种子，用浓度为1000-1500 mg/1的卡那霉素溶液在24-26°C温度下浸种3d，所述卡那霉素溶液与棉花种子的比例为每50ml卡那霉素溶液浸10-12粒棉花种子； (2)播种 将浸泡后的转基因棉花种子用自来水冲洗后播种到装有蛭石的纸桶中或直接播种到蛭石中； (3)筛选转基因植株 当出苗3-5d后，根据棉花子叶上有无白化斑判断是否为转基因植株，将有白化斑的棉花苗即阴性植株拔除，棉花子叶上没有白化斑的绿苗即为阳性植株； (4)分子鉴定 对上述第(3)步中筛选的阳性植株再通过PCR检测进一步确认； (5)移栽 将进一步确认后的阳性植株炼苗后移栽到田间。
全文摘要
本发明涉及一种用低浓度的卡那霉素溶液浸种筛选和鉴定转基因棉花的方法，技术要点如下取转化含有nptⅡ标记基因的棉花种子，用浓度为1000-1500mg/l的卡那霉素溶液在24-26℃温度下浸种3d，所述卡那霉素溶液与转基因棉花种子的比例为每50ml卡那霉素溶液浸8-12粒转基因棉花种子；将浸泡后的转基因棉花种子用自来水冲洗后播种到装有蛭石的纸桶中；当出苗3d后，根据棉花子叶上有无白化斑判断是否为转基因植株，将有白化斑的转基因棉花苗即阴性植株拔除，转基因棉花子叶上没有白化斑的绿苗即为阳性植株，然后进行分子鉴定和移栽。本发明的优点是成本较低、操作简单、准确可靠、容易掌握、出结果早。
文档编号A01H1/04GK102696477SQ201210233348
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者刘永伟, 吕孟雨, 孙果忠, 张俊敏, 张欢欢, 徐显, 朱金勇, 杨帆, 柴建芳, 王海波, 石学萍, 董福双, 赵和, 韩秋芬 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所