专利名称：利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法及该方法在水稻氮素营养高效利用方面的应用。
背景技术：
氮素是细胞原生质的重要组成成分，是所有生命必需的基本营养元素，是植物首要的、需求量最大的营养元素，在植株构建、能量代谢及品质形成等过程中发挥着不可代替的作用，它对植物生长及体内含氮化合物有着十分重要的影响。适量的氮素能促进植物营养器官和生殖器官的生长发育，增加绿叶面积，加强光合作用和营养物质的积累。而过量地施用氮肥导致氮肥利用率(NUE)降低、环境严重污染等突出问题。水稻是中国最主要的粮食作物，在农业生产和粮食安全方面具有举足轻重的地位。而氮素是影响水稻产量和品质最为重要的营养元素。水稻对氮的吸收、同化与转运直接影响着其生长和发育状况，从而影响产量和品质。深入研究氮素吸收动态变化规律，有助于采取有效措施调控水稻生长发育过程，提高产量和改善品质，同时能够节约肥料、改善土壤营养结构。微观动态离子流检测技术作为无损、实时、动态、快速的检测方法是鉴别水稻氮素营养利用率的直接工具，利用该技术检测不同品种水稻对不同形态氮nh4+、NO3-的吸收能力，旨在针对水稻氮素营养高效的评价育种需求，为氮肥高产高效提供理论依据和技术支持。NH4+和NO3-是高等植物吸收的两种主要氮素形态，而植株对这两种形态氮素离子的选择性吸收受到植株种类、品种、生长发育阶段和PH值等土壤理化性质因素影响。Mi chae IA等研究黑核桃幼苗时发现，施加合适比例的ΝΗ4+/Ν03_的氮肥能更好地促进黑核桃的生长发育(Michael A.，Nicodemus K. Nitrate reductase activity and nitrogencompounds in xylem exudate of Juglans nigra seedlings -relation tonitrogen source and supply [J] · Trees，2008，22 :685-695.)。(在黑核桃木质部渗出物中硝酸还原酶活性和含氮化合物体现的氮源和补给关系)因此，在植物生长发育的不同时期保持适宜的ΜΤ/ΝΟ3—比例具有重要的作用，所以利用植物根系对ΝΗ4+、Ν03_离子的吸收能力来指导合理施肥，实现氮素高效利用成为可能，本发明以空育131、空育163、绥粳8为实验材料研究不同品种水稻根系对νη4+、ΝΟ3-离子的吸收规律，作为不同品种水稻营养高效利用评价筛选的依据。微观动态离子流检测技术是一项综合性的特异离子/分子检测的电生理技术，核心技术是在电脑自动控制下利用离子/分子选择性微电极在不接触被测样品的情况下检测进出样品的离子/分子的浓度(mM级)、流速(10-12mol -cm-2 及其运动方向等信息。 该技术操作方便、快捷、实时、无损，能真实反映其他技术难以反映的生命活动规律。该技术为生命科学研究提供了一种可视化的技术手段，促进人类探知传统技术无法检测到的信息，已解决了许多科学问题。
为了及时掌握作物生长情况，除根据经验进行外观观察外，往往以地上部分的氮素营养作为判断作物氮素营养状况的依据。基于化学组分分析法的传统氮素营养检测方法操作复杂，分析周期长，时效性差，无法做到作物生长期间的实时、活体检测。叶绿素计(SPAD)法(李刚华，薛利红，尤娟，等.水稻氮素和叶绿素SPAD叶位分布特点及氮素诊断的叶位选择[J].中国农业科学，2007,40(6) :1127-1134.； Arregui L M, Lasa B, Lafarga A, Iranneta I, Baroja E, Quemada M. Evaluation of chlorophyll meters astools for N fertilization in winter wheat under humid Mediterraneanconditions (潮湿地中海条件下，叶绿素含量作为氮肥施用的评价工具).Eur J Agron, 2006, 24 140-148.)能快速测定作物叶绿素水平及快速诊断作物氮素水平。但叶绿素计采集的信息面偏小，工作量较大，对测定规范有较高的要求，而且诊断标准难掌握。SPAD值会受年份、地点、品种、土壤性状、作物生长季节及生长环境的影响。光谱技术(谭昌伟，庄恒扬，周清波.水稻叶片营养的光谱诊断研究[J].扬州大学学报农业与生命科学版，2009，3(K2) :50-53.；张立周等.数字图像技术在夏玉米氮素营养诊断中的应用[J].中国生态农业学报，2010，18 (6) :1340-1344.；李红军等.应用数字图像进行小麦氮素营养诊断中图像分析方法的研究[J].中国生态农业学报，2011， 19(1) :155-159.)具有信息获取快速、经济、可操作性好、非破坏性等优点，也可发展为远程诊断技术，最近发展较为快速。然而，光谱技术还不够成熟，而影响光吸收和反射的因素很多，且作物品种间冠层色彩参数存在差异，应尽量减少误差，使光谱技术做为氮素诊断方法更加准确，更好地应用于作物的氮素诊断。如上所述，以往分析作物氮素营养利用效率时常用化学分析方法、叶绿素计 (SPAD)法、光谱技术等方法。如基于化学组分分析法的传统氮素营养检测方法操作复杂， 分析周期长，时效性差，无法做到作物生长期间的实时、活体检测；而光谱技术还不够成熟， 而影响光吸收和反射的因素很多，且作物品种间冠层色彩参数存在差异，误差较大。上述这些方法虽然在一定程度上改善了经验施肥带来的盲目性和氮肥过量的问题，但仍不能简便、快速、实时、无损、准确地进行氮素营养形态诊断并指导施肥。因此，开发新的检测水稻真菌性立枯病的方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明旨在为水稻育苗、水稻育种、水稻栽培提供一种快速、无损的检测水稻氮素营养的方法，以应用于水稻氮素营养高效利用方面。具体地，本发明提供一种利用微观动态离子流检测技术检测水稻氮素营养的方法，采用BI0-001B系统检测。所述方法包括以下步骤1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；2)将经过步骤1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测；
4)对检测结果进行处理和分析。进一步地，所述方法包括以下步骤1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1 1. 5cm，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 15min ；4)对检测结果进行处理和分析。更进一步地，所述方法包括以下步骤1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端1cm，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；2)将经过步骤(1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测15min ；4)对检测结果进行处理和分析。在所述方法中，检测使用的水稻处于幼苗期。所述微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度范围为0. 05 0. 15mM。检测使用的水稻处于2叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖100 400 μ m的根尖分生区的外表面10 45 μ m处。所述步骤1)中电极的前端吸入液体离子交换剂的长度为NH4+:20 50μπι ；Ν03、40 60μπι。所述步骤1)中的灌充液为NH4+ 80 140mM NH4Cl ；NOf 80 140mM CaCl2。所述步骤2)中的校正液为NH4+ :0· 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；NOf :0· 05 0. 15mM KNO3 和 0. 5 1. 5mM KNO3 ；校正后电极的能斯特方程计算理想值为NH4+ 56 60mV ；N03、56 60mV;所述步骤幻所述的测试缓冲液为NH4+ :0· 8 1. 2mM KC1、0. 05 0. 15mM CaCl2、0· 05 0. 15mMNH4Cl。NOf :0. 05 0. 15mM KNO3>0. 8 1. 2mM KCl、0· 05 0. 15mMCaCl2。本发明还提供所述利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法在水稻氮素营养高效利用方面的应用。
以空育131水稻幼苗为参照材料检测NH4+离子的吸收流速绝对值大于 18. 44pmol ^nT2 · S—1即评价为NH4+离子利用高效植株；检测N03_离子的吸收流速绝对值大于96. 4Ipmol · cm—2 · S-1即评价为N03_离子利用高效植株。NH4+离子吸收流速绝对值大于18. 44pmol · cm_2 · S—1和N03_离子的吸收流速绝对值大于96. 41pmol · cm—2 · S-1 一同具备的材料可判断为氮素营养利用高效型水稻品种。通过测得的NH4+离子和N03_离子的吸收流速，能够指导合理施肥，实现氮素高效利用成为可能。本发明利用微观动态离子流检测技术可测得水稻氮素营养高效利用离子流信息， 通过不同水稻品种比较，获得不同水稻氮素营养高效利用离子流吸收或释放规律，利用此规律评价水稻氮素营养高效利用，从而实现对水稻氮素营养利用的快速、无损检测，检测后的植株材料还能够正常生长，避免了珍贵水稻苗的损失，检测结果对比明显，方法可靠，为水稻育苗、水稻育种、水稻栽培提供了一种快速、无损的检测氮素营养的新方法。此外，利用微观动态离子流检测技术直接检测水稻氮素营养利用直接相关的NH4+ 和NO3—避免了间接检测的各种方法的不足，直接从检测相应离子吸收速率判断水稻氮素营养的利用差别，鉴别水稻氮素营养利用效率不同的差异个体。
图1为本发明利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法的实验过程图。图2为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NH4+离子动态吸收分析图 (实时流速)；图3为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8NH4+平均离子流速分析图 (平均流速)；图4为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8N03-离子动态吸收分析图 (实时流速)；图5为本发明实施例1中的空育131、空育163、绥粳8N03-平均离子流速分析图 (平均流速)；其中，图2、4中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm_2. 横坐标为时间，单位为秒 (s)；图3、5中纵坐标为离子流速，单位为pmol. cm—2· s-1。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。水稻品种空育131(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、空育163(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、绥粳8 (黑龙江省农科院绥化农业科学研究所)。实施例11.实验材料及培养条件为水稻品种空育131(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、空育163(黑龙江省农垦科学院水稻研究所)、绥粳8 (黑龙江省农科院绥化农业科学研究所)，种子经过10%次氯酸钠消毒30min，蒸馏水冲洗后，置于底垫湿润滤纸的培养皿上，25°C光照培养箱内萌发，发芽后加入Hogland营养液培养，生长至两叶一心期时，测试其根系的离子流。2.实验仪器及耗材微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BI0-001B，YoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端直径为3 μ m。3.实验试剂及溶液(1)液态离子交换剂包括NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich,Louis,M0 63103,USA.NO3- Xuyue (Beijing) Sci. &Tech. Co.，Ltd. Beijing, 100080，P. R. China.(2)测试缓冲液成分NH4+离子0. ImM NH4ClUmM KC1、0. ImM CaCl2NOf 离子0. ImM KNO3UmM KC1、0. ImM CaCl2(3)电极灌充液NH4+: IOOmM NH4ClNOf :1 OmM KNO3(4)校正液NH4+ 离子0. 05mM 和 0. 5mM NH4ClNOf 离子0. 05mM 和 0. 5mM KNO34.实验内容及方法实验过程如说明书附图1所示。从电极末端灌入Icm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度(NH4+ 30 μ m ；NO3- 50 μ m)离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为 NH4+58mV、N(V_58mV。测试前将材料在相应的测试液中平衡35min。然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖400 μ m)表面20 μ m的地方振动检测，每个样品检测15min。5.数据处理离子流处理基于Fick' s扩散定律，并通过在线软件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)计算得出。由大于 3 次独立实验所得到的数据做统计分析，利用EXcel2003分析作图。6实验评价结果如图2和图3所示，三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收NH4+离子幅度不同，其离子吸收平均流速分别为-24. 88pmol ·αιΓ2 入-33. 58pmol ·αιΓ274pmol ·αιΓ
2 · S-1。如图4和图5所示，三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗对Ν03_吸收幅度很大，离子吸收平均流速分别为-102. 48pmol ·αιΓ2 人-261. 8Ipmol ·αιΓ2 ·8"\-253. 38pmol *c m_2 · S—1。实施例21.实验材料及培养条件同实施例1。2.实验仪器及耗材微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BI0-001B，YoungerUSA Sci. &Tech.Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端直径为2 μ m。3.实验试剂及溶液(1)液态离子交换剂包括NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich,Louis,M0 63103,USA.N03_ Xuyue (Beijing) Sci. &Tech. Co. ，Ltd. Beijing, 100080, P. R. China.(2)测试缓冲液成分NH4+ 离子0. 05mM NH4CUO. 8mM KCl、0. 05mM CaCl2NO3-离子0. 05mM KN03、0. 8mM KCl、0. 05mM CaCl2(3)电极灌充液NH4+: IOOmM NH4ClNOf :1 OmM KNO3(4)校正液NH4+ 离子0. 15mM 和 1. 5mMNH4ClNO3-离子:0. 15mM 和 1. 5mM KNO34.实验内容及方法实验过程如说明书附图1所示。从电极末端灌入1. 5cm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度(NH； 20 μ m ；NO3^ 40 μ m)离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为 NH4+ :56mV、N03_ :56mV。测试前将材料在相应的测试液中平衡30min。然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖100 μ m)表面10 μ m的地方振动检测，每个样品检测lOmin。5.数据处理离子流处理基于Fick' s扩散定律，并通过在线软件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)计算得出。由大于 3 次独立实验所得到的数据做统计分析，利用EXcel2003分析数据。6实验评价结果三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收NH4+离子幅度不同，其离子吸收平均流速分别为-20. OOpmol · CnT2 · S-1、-31. Olpmol · cnT2 · S人-35. 22pmol · cnT2 · S人三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗对N03_吸收幅度很大，离子吸收平均流速分别为-100. 03pmol · cnT2 · S-1、-260. 55pmol · cnT2 · S人-251. 74pmol · cnT2 · S-1。实施例31.实验材料及培养条件同实施例1。2.实验仪器及耗材微观动态离子流检测用非损伤微测系统(BI0-001B，YoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)，系统软件imFlux，玻璃微电极尖端直径为4 μ m。3.实验试剂及溶液(1)液态离子交换剂包括NH4+Ammonium ionophore I-cocktail A ；Sigma-Aldrich, Louis, MO 63103, USANOf :Xuyue (Beijing) Sci. &Tech. Co.，Ltd. Beijing, 100080，P. R. China.
(2)测试缓冲液成分NH4+离子0. 15mM NH4ClU. 2mM KCl、0. 15mM CaCl2NOf 离子0. 15mM KNO3U. 2mM KCl、0. 15mM CaCl2(3)电极灌充液NH4+: IOOmM NH4ClN03、IOmM KNO3(4)校正液NH4+ 离子0. 15mM 和 1. 5mMNH4ClNO3-离子:0. 15mM 和 1. 5mM KNO34.实验内容及方法实验过程如说明书附图1所示。从电极末端灌入Icm的相应测试离子的灌充液至电极尖端充满，前端吸入适当长度(NH4+ 50 μ m ；NO3- 60 μ m)离子交换剂(LIX)。将电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座。参比电极为固体低渗漏性电极(WPI)。电极在相应的校正液中校正能斯特理想值为 NH4+ :60mV、N03_ :60mV。测试前将材料在相应的测试液中平衡40min。然后在距离水稻根尖分生区(距离根尖400 μ m)表面20 μ m的地方振动检测，每个样品检测40min。5.数据处理离子流处理基于Fick' s扩散定律，并通过在线软件MageFluX-3DI0n Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)计算得出。由大于 3 次独立实验所得到的数据做统计分析，利用EXcel2003分析数据。6.实验评价结果三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗吸收NH4+离子幅度不同，其离子吸收平均流速分别为-18. 44pmol · cnT2 · S入-28. 15pmol · cnT2 · S人-36. 65pmol · cnT2 · S人三种水稻空育131、空育163、绥粳8幼苗对NO3-吸收幅度很大，离子吸收平均流速分别为-96. 4Ipmol · cnT2 · S-1、-251. 76pmol · cnT2 · S人-241. 35pmol · cnT2 · S-1。因此，本发明以空育131水稻幼苗为参照材料检测NH4+离子的吸收流速绝对值大于18. 44pmol · cm—2 · S—1即评价为NH4+离子利用高效植株；检测N03_离子的吸收流速绝对值大于96. 4Ipmol · cm_2 · S—1即评价为N03_离子利用高效植株；而NH4+离子吸收流速绝对值大于18. 44pmol · cm_2 · S—1和N03_离子的吸收流速绝对值大于96. 4Ipmol · cm_2 · S—1 — 同具备的材料可判断为氮素营养利用高效型水稻品种。本实施例中的空育163和绥粳8即为氮素营养高效利用型水稻品种。由上述实施例可以看出，三种水稻空育131、空育163、绥粳8吸收N03_离子的能力和NH4+离子的能力都不尽相同，说明不同品种的水稻对氮肥的利用效率不同。利用参照的水稻品种空育131的离子流检测结果作为标准，来判断其他品种对NH4+、NO3-离子的吸收能力的差别鉴别不同水稻品种的氮素营养利用效率。本方法可作为水稻氮素营养高效利用的评价手段，合理精确施加不同形态氮肥的一种快速有效的技术手段，同时也为水稻氮素营养高效育种提供无损、快速的筛选方法。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用微观动态离子流检测技术检测水稻氮素营养的方法，采用BI0-001B系统检测，其特征在于，其包括以下步骤.1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；.2)将经过步骤1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；.3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测；.4)对检测结果进行处理和分析。
2.根据权利要求1中所述的利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法，其特征在于，所述步骤1)为向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端.1 .1.5cm，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；所述步骤幻为取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测10 15min。
3.根据权利要求1中所述的利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法，其特征在于，所述步骤1)为向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端.1cm，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；所述步骤幻为取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡30-40min，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测15min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于幼苗期。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微观动态离子流检测技术中测试缓冲液中的测试离子浓度范围为0. 05 0. 15mM。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，检测使用的水稻处于2叶1心期，测量位置为距所述水稻苗根尖100 400 μ m的根尖分生区的外表面10 45 μ m处。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中电极的前端吸入液体离子交换剂的长度为NH4+ :20 50μπι ； NOf 40 60μπι。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的灌充液为 NH4+ IOOmM NH4Cl ；NO, JOmMKNO3 ；所述步骤2)中的校正液为NH4+ :0. 05 0. 15mM NH4Cl 和 0. 5 1. 5mM NH4Cl ；NOf 0. 05 0. 15mM KNO3 和 0. 5 1. 5mM KNO3 ；校正后电极的能斯特方程计算理想值为NH4+ 56 60mV ；NOf 56 60mV。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤幻所述的测试缓冲液为NH4+ :0. 8 1. 2mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mMNH4Cl ； NOf :0. 05 0. 15mM ΚΝ03、0. 8 1. 2mM KCl、0. 05 0. 15mMCaCl2。
10.权利要求1-9中所述的利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法在水稻氮素营养高效利用方面的应用。
全文摘要
本发明提供一种利用微观动态离子流技术检测水稻氮素营养的方法，该方法包括以下步骤1)向微电极灌入离子灌充液至充满所述电极尖端，再将电极前端吸入相应测试离子交换剂；2)将经过步骤1)处理后的电极套入已氯化的Ag/AgCl电极线基座，并放入校正液中校正；3)取待测水稻苗，将其根部先放在测试缓冲液中平衡，再用校正后的电极对待测水稻苗进行检测；4)对检测结果进行处理和分析。该方法主要针对于水稻，实现了对水稻氮素吸收能力的无损、快速、准确检测，耗时短，检测准确性高，不同品种水稻幼苗对不同形态氮素吸收的净离子流对比差异明显，方法简单可靠，为水稻氮素营养高效育种提供无损、快速的筛选方法。
文档编号A01G7/00GK102539507SQ20111042752
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者于春花, 侯佩臣, 姜富斌, 王成, 王晓冬, 赵春江 申请人:北京农业智能装备技术研究中心