专利名称：具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法
技术领域：
本发明涉及具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。属生物工程技术应用领域。
背景技术：
茶树菇属担子菌纲，粪锈伞科，田菇属，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年来发展起来的一种食用菌新品种。茶树菇营养丰富，蛋白质含量高，含有人体必需的氨基酸，并且有丰富的B族维生素和钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。中医认为该菇性平、甘温、无毒，具有较高的药用价值，有清热、平肝、明目、健脾的功效。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。通过深层发酵获得一种天然的具有抑菌作用的发酵液，可应用于化妆品的抑菌防腐。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。本发明的技术方案为将茶树菇子实体通过组织分离法接入固体斜面培养基上培养，待长好后移至摇瓶种子液体培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，将发酵液浓缩，脱蛋白，透析后得到澄清的黄色液体，滤过除菌后进行抑菌实验。上述过程中，斜面培养基为PDA培养基，摇瓶种子培养基为PDAlL加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. 0，发酵培养基为玉米粉2g/100mL、酵母粉 0. 3g/100mL、磷酸二氢钾 0. 2g/100mL、硫酸镁 0. 05g/100mL,培养条件为起始 pH6. 0，250mL 三角瓶装培养基IOOmL于25°C，150r/min，振荡培养7d，离心后上清液用Sevage法去除游离蛋白质，蒸馏水透析去除无机盐，得到茶树菇发酵液。滤过除菌后用滤纸片法进行抑菌实验。
具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例一1.发酵液制备出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；(1)组织分离法斜面培养基PDA培养基，含1.5% 2.0%琼脂，pH自然；组织分离方法将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，PH自然，置于25°C温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；(2)摇瓶种子培养
摇瓶种子培养基PDA1L加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg， ρΗ6· 0 ；培养方法从斜面菌种中取3 4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基IOOmL于25°C，150r/min，振荡培养7d ；(3)摇瓶发酵培养发酵培养基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氢钾0. 2g/100mL、硫酸镁 0.05g/100mL ；培养方法将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中25°C，150r/ min,振荡培养7d ；(4)发酵液浓缩，脱蛋白，透析培养后离心，取上清液旋转蒸发仪浓缩后用kvage法去除游离蛋白，即按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。然后取上清液中装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔 12小时换水一次，得发酵液。2.滤过除菌上述液体通过0. 22 μ m的滤膜除菌。实例二对茶树菇发酵液样品进行了氨基酸组成，单糖组成的测定，测定结果表明，所含氨基酸中谷氨酸占18%以上，天冬氨酸占12%以上，甘氨酸占8%以上，赖氨酸占7%以上，丙氨酸占6%以上，所含单糖以葡萄糖为主，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为76.3%。茶树菇发酵液的氨基酸组成及含量见表1。表1茶树菇发酵液的氨基酸组成及含量
权利要求
1.一种具有抑菌作用的茶树菇发酵液，其特征在于外观为淡黄色液体，是茶树菇通过深层发酵获得的发酵液经过浓缩，脱蛋白，透析，滤过除菌后制得。其中发酵液所含氨基酸中谷氨酸占18%以上，天冬氨酸占12%以上，甘氨酸占8%以上，赖氨酸占7%以上，丙氨酸占6%以上，然后通过滤纸片法进行抑菌活性实验，结果表明其对常见致病菌，尤其是肠道致病菌有一定抑制作用。
2.权利要求1所述的发酵液的制备方法。该方法由下列步骤组成(1)菌种培养出发菌种为市售茶树菇(Agrocybe aegirit)；①组织分离法斜面培养基PDA培养基，含丨；^ ？^^琼脂，？!！自然；组织分离方法将子实体外表用酒精进行表面消毒后，放入超净工作台上，用消毒过的刀片与镊子切取菌柄与菌盖交界处组织块接入斜面培养基上，PH自然，置于25°C温度下暗培养，5d后菌丝开始萌发，每隔2d检查1次，除去污染，选择菌丝生长速度快和长势强的试管作为纯母种；②摇瓶种子培养摇瓶种子培养基PDA1L加磷酸二氢钾lg，硫酸镁0. 5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，pH6. O ；培养方法从斜面菌种中取3 4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中， 250mL三角瓶装培养基IOOmL于25°C，150r/min，振荡培养7d ；③摇瓶发酵培养发酵培养基玉米粉2g/100mL、酵母粉0. 3g/100mL、磷酸二氢钾0. 2g/100mL、硫酸镁 0.05g/100mL ；培养方法将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中25°C，150r/min， 振荡培养7d ；(2)发酵液浓缩，脱蛋白，透析培养后离心，取上清液旋转蒸发仪浓缩后用kvage法去除游离蛋白，然后取上清液透析。(3)滤过除菌上述液体通过0. 22 μ m的滤膜除菌。
3.如权利要求1所述的抑菌实验所用滤纸片的制备方法，其特征在于用打孔器将新华 1号定性滤纸打成直径6mm的小圆片，于培养皿中121°C湿热灭菌30min，将灭菌滤纸片浸入茶树菇发酵液中，浸泡24h后取出。
4.如权利要求1所述的抑菌实验菌种包括金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、枯草芽胞杆菌、 伤寒杆菌、面包酵母、黑根霉、曲霉。
5.如权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于所述用kvage法去除游离蛋白，是按发酵液1/5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1/5的正丁醇，混合后振荡20min。 蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。
6.如权利要求2所述的发酵液的制备方法，其特征在于所述的透析是指将去除游离蛋白质的发酵液装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次。
全文摘要
本发明属生物工程技术应用领域，具体涉及具有抑菌作用的茶树菇发酵液的制备方法。该茶树菇发酵液为黄色液体，是茶树菇深层发酵后的液体经过浓缩，脱蛋白，透析得到的。该发酵液所含氨基酸中谷氨酸占18％以上，天冬氨酸占12％以上，甘氨酸占8％以上，赖氨酸占7％以上，丙氨酸占6％以上，具有一定的抑菌作用，可应用于化妆品的抑菌防腐。
文档编号A01G1/04GK102523916SQ20111041989
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者滕丽萍, 程咏梅, 邓超, 陈敬华, 陈荆晓 申请人:江南大学