专利名称：一种农杆菌介导的芝麻遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及一种以芝麻下胚轴为外植体的农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，属于植物转基因技术领域。
背景技术：
近年来转基因技术已成为植物分子生物学研究强有力的实验手段，更是基因功能和基因组研究必不可少的实验工具。由于芝麻属于植株再生较困难的作物，芝麻转基因技术进展缓慢。我国尚未有芝麻转基因获得成功的研究报道，国外公开报道的芝麻转基因技术多采用农杆菌侵染茎尖等外植体，通过诱导丛生芽获得转基因植株。但由于此方法不具有重复性，转化效率低，不能很好地用于芝麻分子生物学研究。因此，当前急需探讨一种稳定高效的芝麻遗传转化技术方法，为芝麻重要基因的功能验证及芝麻T-DNA插入突变体库构建等提供技术支撑。
发明内容
本发明目的在于提供一种以芝麻下胚轴为外植体，采用农杆菌介导进行外源基因转化成功获得抗性芝麻愈伤组织及植株农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法，由以下方法获得(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体，进行农杆菌侵染和共培养；(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生；(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株；(4)通常PCR和⑶S染色方法检测植株。步骤(1)中外植体的获得方法如下首先挑选饱满健康的芝麻种子，在超净工作台内表面消毒后，加入无菌水培养到种子露白；然后在无菌条件下接种于培养基上，在 25°C 的温度下培养，下胚轴长约4-5cm时，将下胚轴切成0. 2-0. 8cm时小段待用。所述的培养基的组成为MS培养基+30g · L—1蔗糖+8g · L—1琼脂粉，pH为5. 8。步骤(1)的侵染和共培养为在超净工作台上，用共培养液体培养基将带有表达载体质粒(如PBI121)的农杆菌4404菌株稀释至OD6tltl值为0.5;将切好的0. 5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中，IOmin后，用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液；将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基上，用封口膜封口，共培养2天。所述的液体培养基组成为MS+0. Img · L"1NAA+2mg · Ll-BA+SOg · Γ1蔗糖，ρΗ为 5. 8。所述的固体培养基组成为MS+0. Im g ·L"1NAA+2mg ·T^-BA+SOg ·Γ1 蔗糖 +8g .L—1 琼脂，pH为5. 8。步骤C3)的抗性愈伤组织诱导及再生具体为先共培养2天后，将外植体放于抗性愈伤诱导培养基上；待愈伤上出现绿色的小芽时，将其剥离继代到抗性筛选培养基上，之后进行生根培养。
所述的抗性愈伤诱导培养基组成为MS+0. Img · r1NAA+2mg · Ll-BA+Sg · L—1琼脂 +30mg · L-1卡那霉素+500mg g · L-1头孢霉素+30g · L-1蔗糖。
所述的继代到抗性筛选培养基组成为MS+8g · Γ1琼脂+20mg · L—1卡那霉素 +200mg · L-1 头孢霉素 +30g · L-1 蔗糖，pH 为 5. 8。
本发明的方法以芝麻下胚轴为外植体，采用农杆菌介导方式，在转化过程中筛选使用最适于芝麻遗传转化的农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间、抗生素筛选浓度和时间， 诱导出抗性愈伤及抗性植株，最终获得了芝麻转基因植株。本发明建立了一套完整的农杆菌介导的芝麻遗传转化技术体系，利用该方法可以高效地获得芝麻抗性愈伤组织，并成功完成愈伤组织分化和转基因植株再生过程；解决了芝麻遗传转化的技术难题，为芝麻重要基因的功能验证、T-DNA插入突变体库构建等研究奠定了技术基础，促进了我国芝麻基因工程技术的发展。具有以下优点(1)以芝麻萌发种子的下胚轴为外植体，并采用农杆菌介导方法完成遗传转化，试验材料的预处理及试验操作步骤简便易行，周期短，试验开展不受芝麻生产季节限制；( 该方法通过愈伤组织诱导及分化等步骤获得转基因植株，遗传转化效率高，成本低，且转基因材料繁殖快速方便，可在短时间内为芝麻功能基因研究提供大批试验材料；C3)该方法可用于今后的芝麻基因组大片段的转基因研究、芝麻转基因种质创新和突变体库构建以及重要基因的功能分析等研究。
图1是下胚轴与农杆菌共培养；
图2是农杆菌浸染后，对下胚轴进行愈伤组织诱导培养；
图3是对抗性愈伤组织进行分化培养；
图4是获得的抗性再生幼苗；
图5是对获得的抗性再生植株进行生根培养；
图6是抗性再生植株营养钵移栽；
图7是转基因植株的PCR检测，M :DL2000 ；1 以水为模板的阴性对照；2 未进行遗传转化的普通植株；3 假阳性转基因植株；4 阳性转基因植株；
图8是转基因愈伤的⑶S染色检测，1 阴性对照；2-3 假阳性转基因植株，⑶S染色为无色；4 阳性转基因植株，GUS染色为兰色；
图9是转基因植株叶片GUS染色(左图为对照；右图为转基因植株GUS染色为阳性)。
具体实施方式
本实施例以农杆菌介导的pBI121空表达载体芝麻遗传转化的方法，包括以下步骤
(1)无菌外植体的获得
1)挑选饱满健康的野芝1号芝麻种子，在超净工作台内用70%乙醇表面消毒种子lmin，然后用3%次氯酸钠消毒8 IOmin ；无菌水冲洗种子3次，加入无菌水振荡培养 18-24h，待到种子露白；
2)在无菌条件下接种于培养基(MS培养基+30g · Γ1蔗糖+8g · Γ1琼脂粉，pH = 5. 8)上，25°C 培养，6d后将下胚轴切成0. 5cm左右小段待用；(2)浸染和共培养1)农杆菌活化挑取带有表达载体质粒PBI121的农杆菌4404菌株，接种于农杆菌液体培养基中(LB液体培养基+50mg · Γ1卡那霉素+20mg · Γ1利福平，pH = 7.0)，28 V 振荡培养，用于活化菌株；2)农杆菌培养蘸取少量农杆菌菌液在平板培养基(LB固体培养基+50mg 卡那霉素+20mg. Γ1利福平，pH = 7. 0)划单菌落培养，下过夜。挑取单菌落于农杆菌液体培养基中(成分同上振荡培养。待菌株进入对数生长期时，离心收集菌体。然后用LB液体共培养基悬浮，使0D_约为0. 5 ；3)农杆菌侵染前处理在超净工作台上，用共培养液体培养基(MS+0. Img -L^1NAA+ 2mg -L^e-BA+SOg -Γ1蔗糖，pH = 5. 8)将带有表达载体质粒pBI121的农杆菌4404菌株稀释至OD6tltl值为0. 5 ；4)将切好的0. 5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中，IOmin后，用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液；5)将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基(MS+0. Img r1NAA+2mg · L^e-BA+SOg · L-1蔗糖+8g · L-1琼脂，pH = 5. 8)上，用封口膜封口，共培养2天(图1)；(3)抗性愈伤组织诱导及再生1)共培养2天后，将外植体放于抗性愈伤诱导培养基(MS+0. Img r1NAA+2mg -^6 -BA+8g · L-1琼脂+30mg · L-1卡那霉素+500mg · L-1头孢霉素+30g · L—1蔗糖)上(图2)；2)待愈伤上出现绿色的小芽时(图3)，将其剥离继代到抗性筛选培养基 (MS+8g · L-1 琼脂 +20mg · L-1 卡那霉素 +200mg · L-1 头孢霉素 +30g · L-1 蔗糖，pH = 5. 8)上 (图4)，之后进行生根培养(图5)及植株移栽(图6)；(4)转基因植株的检测DPCR检测无菌条件下取小植株2-3片叶，提取DNA，进行标记基因的PCR扩增 (图7)，⑶S基因引物为Forward Prim er 5' -TTGCA ACTGGACAAGGCACTAGCGG-3，；Reverse Primer :5’ -ACATTGACGCAGGTGATCGGACGC-3，，扩增片段长度为712bp，扩增程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火 lmin, 72°C延伸 40s, 35 个循环，72°C延伸 IOmin ；2)⑶S染色检测抗性愈伤gus基因组织化学检测将0. Ig愈伤置于1. 5mL无菌的Eppendorf管中，加入200 μ L gus组织化学检测液，37°C保温摇晃培养过夜，70%的酒精洗涤愈伤三次，呈现蓝色的愈伤为阳性愈伤。以未转基因的作为对照，(图8)。再生植株叶片gus基因组织化学检测将切成小块的叶片转到0.5mL无菌的 Eppendorf管中，加入20 μ L gus组织化学检测液，37 °C保温培养过夜，70 %的酒精洗涤三次，呈现深蓝色者为阳性。以未转基因的作为对照，(图9)。gus组织化学检测液组成50mmol · L-I 磷酸钠缓冲液(ρΗ7· 0)，5mmol · L_lK4Fe (CN) 6，5mmol · L_lK3Fe (CN) 6， IOmmol · L_1EDTA，0. 1% TritonX-10,0. Img · mL-lX-Gluc。
权利要求
1.一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法，其特征在于由以下方法获得(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体，进行农杆菌侵染和共培养；(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生；(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株；(4)通常PCR和⑶S染色方法检测植株。
2.根据权利要求1所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于步骤(1)外植体的获得方法如下首先挑选饱满健康的芝麻种子，在超净工作台内表面消毒后，加入无菌水培养到种子露白；然后在无菌条件下接种于培养基上，在25°C 的温度下培养，下胚轴长约4-5cm时，将下胚轴切成0. 2-0. 8cm时小段待用。
3 根据权利要求2所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于所述培养基的组成为MS培养基+30g · L-1蔗糖+Sg · L-1琼脂粉，pH为5. 8。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法，其特征在于步骤(1)的侵染和共培养为在超净工作台上，用共培养液体培养基将带有表达载体质粒pBI121的农杆菌4404菌株稀释至OD6tltl值为0. 5 ；将切好的0. 5cm芝麻下胚轴小段浸泡在农杆菌液体中，IOmin后，用灭菌滤纸吸干外植体周围多余的菌液；将外植体放在铺有一层灭菌滤纸的共培养固体培养基上，用封口膜封口，共培养2天。
5.根据权利要求4所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于所述的液体培养基组成为:MS+0. Img ·厂1 NAA+2mg · Γ1 6_BA+30g · Γ1 蔗糖，ρΗ 为 5. 8。
6.根据权利要求4所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于所述的固体培养基组成为 MS+0. Im g · Γ1 NAA+2mg · Γ1 6_BA+30g · Γ1 蔗糖 +8g · Γ1 琼月旨，ρΗ 为 5. 8。
7.根据权利要求1所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于步骤(3)的抗性愈伤组织诱导及再生具体为先共培养2天后，将外植体放于抗性愈伤诱导培养基上；待愈伤上出现绿色的小芽时，将其剥离继代到抗性筛选培养基上，之后进行生根培养。
8.根据权利要求7所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于所述的抗性愈伤诱导培养基组成为:MS+0. Img · L-1 NAA+2mg · L-1 6_BA+8g · L-1琼脂+30mg · L-1卡那霉素 +500mg · L-1 头孢霉素 +30g · L-1 蔗糖。
9.根据权利要求7所述农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，其特征在于所述的继代到抗性筛选培养基组成为MS+8g化―1琼脂+20mg化―1卡那霉素+200mg化―1头孢霉素+30g化一1 蔗糖，PH为5. 8。
全文摘要
本发明涉及了一种农杆菌介导的芝麻遗传转化的方法，由以下方法获得(1)以萌发芝麻种子的下胚轴为外植体，进行农杆菌侵染和共培养；(2)对外植体进行抗性愈伤组织的诱导及再生；(3)通过获得抗性愈伤组织进而获得抗性再生植株；(4)通过PCR和GUS染色方法检测植株。具有以下优点(1)以芝麻萌发种子的下胚轴为外植体，并采用农杆菌介导方法完成遗传转化，试验材料的预处理及试验操作步骤简便易行，周期短，试验开展不受芝麻生产季节限制；(2)该方法通过愈伤组织诱导及分化等步骤获得转基因植株，遗传转化效率高，成本低，且转基因材料繁殖快速方便，可在短时间内为芝麻功能基因研究提供大批试验材料；(3)该方法可用于今后的芝麻基因组大片段的转基因研究、芝麻转基因种质创新和突变体库构建以及重要基因的功能分析等研究。
文档编号A01H4/00GK102492721SQ20111041245
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者张海洋, 琚铭, 苗红梅, 魏利斌 申请人:河南省农业科学院