专利名称：一种刺槐的繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及刺槐离体培养和植株再生的方法，属于刺槐的组织培养领域。
背景技术：
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又称洋槐，属于豆科(Leguminosae)蝶形花亚科刺槐属(Robinia L.)，落叶乔木，原产于美国，天然分布于美国东部阿柏拉契山脉 (Appalachian. Mt.)和奥萨克山脉(Ozank. Mt. ),20世纪初期引入我国，引进后得到迅速扩大栽植，是黄河中下游、淮河流域、海河流域、长江下游诸省的主要用材林、薪炭林、水土保持林、海提及河提防护林，仅在河北、河南、山东和山西等6省市就有40亿株。它生长速度快，是重要的速生用材树种，其木材材质坚硬、抗压强度大、具较强的耐旱性、防腐力强。刺槐根系长有大量根瘤，可以通过生物固氮增加土壤肥力，在维持生态平衡、提高林分质量等方面发挥重要作用。刺槐的叶片含有粗蛋白，是优质廉价的家畜饲料资源。刺槐花营养丰富，虽花期较短但花量可观，除直接使用外，还可生产花蜜、提取香料等。
中国对刺槐的育种研究始于20世纪70年代，至今已取得很多成就，但仍不能满足林业生产的需要。体细胞胚再生途径是对树木进行繁育和遗传改良的重要平台，也是实现基因转化的常用再生体系。体胚发生技术具有繁殖数量多、速度快、不受亲缘关系限制、一旦形成结构完整的体细胞胚一般都可直接萌发形成小植株等特点，是稳定高效的植物再生体系。此外，体细胞胚胎由单细胞起源，发育程序与合子胚相似，可作为胚胎学研究的模式系统，对细胞全能性表达过程和细胞分化机理等理论问题的研究也具有重要意义。Laine E 和Dumet D成功将加勒比松和油棕胚性愈伤组织在超低温下保存并保持了体胚发生潜力， 解冻后仍能继续培养形成植株，这为挽救濒危植物提供了可能。刺槐的离体培养研究从20 世纪50年代末开始，80年代以后达到高潮。
到目前为止，刺槐通过形成层培养、茎培养、叶片培养、未授粉子房的培养等已获得了完整的植株，但这些研究都集中在器官发生途径，通过体细胞胚发生途径的研究还很少。例如，红艳以刺槐成熟种子的子叶为外植体，对刺槐体胚培养和诱导不定芽进行了研究，但体细胞胚发生率最高也仅有36. 7 %。
大量研究表明，外植体的发育时期是影响体细胞胚发生的关键因素，未成熟合子胚因其细胞全能性高、脱分化容易，在诱导体细胞胚发生时具有显著优势。大多数植物离体培养普遍采用未成熟合子胚外植体，但过于幼嫩或过度成熟的合子胚的体胚诱导率并不理想。在整个合子胚的发育过程中，只有一个较短的阶段具有很强的体胚发生潜能。目前，研究合子胚发育阶段对体细胞胚诱导影响的研究很多，但就刺槐而言，由于刺槐的体细胞胚培养比较困难，表现为体胚诱导率低、畸形胚数量多、体胚质量不高等，制约了其遗传改良的程度，也阻碍了优良无性系的高效繁殖和快速推广。目前，国内外对刺槐的体细胞胚培养的研究相对较少，国内尚未见相关报道，国外仅Merkle et al.和Arrillaga et al.发表了这方面的研究结果。其中，Merkle等人从开花后第1周开始，每隔一周从3棵刺槐树上选取未成熟合子胚为外植体，以MS培养基为基本培养基，研究了外植体胚龄对体胚诱导的影响，仅从开花后4周的一粒未成熟合子胚上观察到体细胞胚发生，其体细胞胚的诱导率低； ArriIlaga等人在Merkle的研究基础上提高了体细胞胚的诱导率，以FM培养基为基本培养基，采用开花后1-4周的为成熟合子胚为外植体，进行体细胞胚诱导培养，试验结果表明开花后2-3周的外植体体胚诱导率最高，仅达到12%。上述研究均是以开花后1-4的未成熟合子胚为外植体进行诱导培养，其诱导率低，最高诱导率仅为12 %，难以满足刺槐繁殖和育种的需要，因此，建立刺槐高效体胚发生体系势在必行。发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种新的刺槐离体培养和植株再生的方法，该方法的刺槐体细胞胚诱导率高、体胚萌发率高，可以在较短时间内形成大量优良的刺槐试管苗，可进行规模化、工厂化生产，可用于刺槐转化体系研究，也可以用于分子育种研究。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种刺槐繁殖方法，包括如下顺序进行的步骤
1)采集刺槐荚果；
2)将刺槐荚果进行表面灭菌处理后取出其合子胚，获得无菌合子胚；
3)将无菌合子胚接种到愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织；
4)将愈伤组织接种于体细胞胚诱导培养基上，进行体细胞胚诱导培养，获得原胚培养物；
5)将原胚培养物接种于体细胞胚成熟培养基中进行体细胞胚的成熟培养，获得体细胞胚；
6)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基上进行萌发培养，获得体胚苗；
7)将体胚苗接种于壮苗培养基上进行壮苗培养，促进体胚苗的生长，获得试管壮苗；
8)将试管壮苗进行炼苗、移栽，即得。
本发明中所述体细胞胚简称体胚。
刺槐的外植体胚龄对愈伤组织的诱导率影响显著，过嫩或过熟的幼胚均不能得到理想的胚性愈伤组织诱导结果。本发明通过大量的实验发现，处于开花后第25天至第75 天这一时间段内的刺槐荚果作为外植体，其胚性愈伤组织诱导效果相比于其它时间段内的荚果有明显的提高；进一步的实验发现，采集处于刺槐开花后第45天至第65天这一时间段内的荚果作为外植体的繁殖效果有进一步的提高，采用处于刺槐开花后第55天至第65天这一时间段内的荚果作为外植体的繁殖效果得到了更进一步的提高，采用处于开花后第阳天的刺槐荚果作为外植体取得了最好的繁殖效果采集刺槐开花后第阳天的荚果中的未成熟合子胚在所有诱导培养基上的出愈率均高于其它时期的外植体，其愈伤组织诱导率为 66. 72-95. 42%、诱导得到的愈伤组织生长速度快，呈淡黄色或嫩黄绿色，结构紧密，呈颗粒状，经多次继代仍能保持较高的活力；其体细胞胚诱导率为76. 88-90. 73%，体胚萌发率为 80-100%，均明显高于其它时段的外植体，所以本发明最优选采集处于开花后第55天的刺4槐荚果作为外植体。
其中，步骤2)中所述灭菌处理包括如下顺序进行的步骤
A)将采集的刺槐荚果用无菌水洗净后，用酒精浸泡荚果后，用无菌水冲洗干净；
B)用HgCl2溶液浸泡荚果，用无菌水冲洗干净；
C)吸干荚果表面水分后从荚果中取出合子胚，即得。
特别是，步骤A)中所述的酒精的体积百分比浓度为75%;浸泡时间为30s ；无菌水冲洗3-5次。
特别是，步骤B)中所述HgCl2溶液的质量百分比浓度为0. 1 % ；浸泡时间为 3-7min，优选为5min ；无菌水冲洗5_6次。
其中，步骤3)中所述的愈伤组织诱导培养基是MS基本培养基+2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MEQ500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3_6mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖 30g/L+琼脂6g/L，pH值为5. 8 ；优选为MS基本培养基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-5. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-3. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5. 8 ；进一步优选为MS基本培养基+MES 500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸1. 0-5. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 3-1. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5. 8 ；更进一步优选为MS基本培养基 +MES500mg/L+2,4- 二氯苯氧基乙酸5. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 6g/L，pH 值为 5.8。
特别是，步骤幻中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行黑暗条件下，培养温度为洸士2°C。
尤其是，愈伤组织诱导培养过程中的相对湿度为60-75%。
其中，步骤4)中所述体细胞胚诱导培养基是MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-2. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-1. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为5. 8 ；优选为MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/ L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-1. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂6g/L，pH值为5. 8 ；进一步优选为MS基本培养基+MES 500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L， pH值为5.8。
特别是，步骤4)中所述体细胞胚诱导培养在以下条件下进行黑暗条件下，培养温度为洸士2°C。
尤其是，体细胞胚诱导培养过程中相对湿度为60-75%。
其中，步骤幻中所述的体细胞胚成熟培养基为MS基本培养基+水解酪蛋白 500mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，pH 值为 5. 8。
特别是，步骤5)中所述体细胞胚成熟培养在以下条件下进行培养温度为 ^±2°C，光照强度为1500-20001UX，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。
尤其是，体细胞胚成熟培养过程中相对湿度为60-75%。
其中，步骤6)中所述的萌发培养基为MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 值为5.8。
特别是，步骤6)中所述萌发培养在以下条件下进行培养温度为^±2°C，光照强度为1500-20001UX，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。
尤其是，体细胞胚萌发培养过程中相对湿度为60-75%。
其中，步骤7)中所述壮苗培养基为MS基本培养基+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，pH 值为 5. 8。
特别是，步骤7)中所述壮苗培养在以下条件下进行培养温度为^±2°C，光照强度为1500-20001UX，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。
尤其是，体胚苗壮苗培养过程中相对湿度为60-75%。
其中，步骤8)中所述的炼苗、移栽包括如下顺序进行的步骤打开培养瓶的瓶盖， 在移栽室中炼苗1天；然后将试管苗取出，用自来水洗净根部残留的琼脂培养基，移栽到刺槐无土栽培基质中进行移栽培养，移栽培养5-6周后再定植于大田。
特别是，还包括将试管苗放置于遮光50%的自然光光照强度下培养5-10天后再打开培养瓶瓶盖。
特别是，所述刺槐无土栽培基质由珍珠岩、蛭石组成，其中珍珠岩与蛭石的体积之比为1 1。
特别是，移栽培养是自然光光照条件下，培养5-6周
尤其是，移栽培养温度为25士5°C、相对湿度为56-90%。
本发明的刺槐的繁殖方法具有以下优点
1、本发明利用刺槐未成熟合子胚进行离体快速繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基的都是MS基本培养基，具有无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾和铵的含量高，可以为组织生长提供所需矿质营养和促进体细胞胚诱导、分化和萌发生长。
2、本发明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，愈伤组织诱导培养基中添加植物生长调节剂利于外植体的愈伤组织的诱导、增殖，愈伤组织诱导率高，可达到95. 42%
3、本发明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，体细胞胚诱导培养基中添加植物生长调节剂利于体细胞胚从愈伤组织上进行诱导、增殖、成熟，萌发和分化，本发明中使用的刺槐培养基中营养物质组成合理，用量和配比适宜，培育结果重复性高，再生体系稳定，体细胞胚的诱导率高，可达到90. 73%。
4、本发明方法培育的刺槐再生苗生长健壮、繁殖系数高，成熟体细胞胚萌发率高， 达到80-100% ；体胚苗移栽成活率高，达到100%，是工厂化大规模生产刺槐植株的简便、快捷的技术体系。
图1是刺槐未成熟合子胚诱导培养得到的愈伤组织；
图2是刺槐愈伤组织诱导培养得到的原胚培养物；
图3是原胚培养物的薄层切片的显微镜观测照片；
图4是刺槐原胚培养物进行成熟培养初期得到的初期培养物；
图5是刺槐原胚培养物通过成熟培养得到的成熟的体细胞胚；
图6是刺槐成熟体细胞胚萌发培养得到的体胚苗；
图7是刺槐体胚苗壮苗培养得到的具有多个茎叶端的丛生试管壮苗；
图8是刺槐体胚苗壮苗培养过程中继代培养得到的具有优势主干的试管壮苗；具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一、试验材料
1、本发明以北京市延庆米家堡苗圃生长良好的二倍体刺槐实生苗群体为取材资源，选取10棵生长良好、干型较直、结实率高的母树(各株之间的间隔大于50米)，在2010 年6月到9月间，采集开花后第4-12周的刺槐不同发育阶段的合子胚作为外植体试验材料，每间隔10天采集一次，每次采集500个荚果，即采集开花后25、35、45、55、65、75天的荚果，每次采集500个荚果，将当天采集的荚果在冰盒中低温保存带回实验室，之后放在4°C 的冰箱里冷藏备用。
2、植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和吲哚丁酸(IBA)。
3、培养基的配制
(1) "MS基本培养基”的组成或配制方法；
表IMS 培养基(Murashige and Skoog, 1962)
权利要求
1.一种刺槐繁殖方法，包括如下顺序进行的步骤1)采集刺槐荚果；2)将刺槐荚果进行表面灭菌后取出其合子胚，获得无菌合子胚；3)将无菌合子胚接种到愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织；4)将愈伤组织接种于体细胞胚诱导培养基上，进行体细胞胚诱导培养，获得原胚培养物；5)将原胚培养物接种于体细胞胚成熟培养基中进行体细胞胚的成熟培养，获得体细胞胚；6)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基上进行萌发培养，获得体胚苗；7)将体胚苗接种于壮苗培养基上进行壮苗培养，促进体胚苗的生长，获得试管壮苗；8)将试管壮苗进行炼苗、移栽，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的刺槐荚果是处于刺槐开花后第25天至第75天这一时间段内的刺槐荚果，优选为处于刺槐开花后第45天至第65天这一时间段内的刺槐荚果，更优选为处于刺槐开花后第阳天至第65天这一时间段内的刺槐荚果，最优选为刺槐开花后第阳天的刺槐荚果。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述愈伤组织诱导培养基是MS基本培养基+2-(N-吗啡啉)乙磺酸500mg/L+2，4- 二氯苯氧基乙酸0. 3-6. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤 0-3. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，pH 值为 5. 8。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征是步骤幻中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行黑暗条件下，培养温度为^±2°C。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤4)中所述体细胞胚诱导培养基是MS基本培养基+2-(N-吗啡啉)乙磺酸500mg/L+谷氨酰胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸 0. 1-2. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤 0-1. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，pH 值为 5. 8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤4)中所述体细胞胚诱导培养在以下条件下进行黑暗条件下，培养温度为^±2°C。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述的体细胞胚成熟培养基为MS基本培养基+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤6)中所述的萌发培养基为MS基本培养基 +蔗糖30g/L+琼脂6g/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤7)中所述壮苗培养基为+吲哚丁酸0.2mg/ L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L。
10.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述体细胞胚成熟培养、步骤6)中所述萌发培养或步骤7)中所壮苗培养在以下条件下进行培养温度为^±2°C，光照强度为1500-20001UX，光照周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗；步骤8)中所述的炼苗移栽包括如下顺序进行的步骤打开培养瓶的瓶盖，在移栽室中炼苗1天；然后将试管苗取出， 用自来水洗净根部残留的琼脂培养基，移栽到刺槐无土栽培基质中进行移栽培养5-6周后再定植于大田。
全文摘要
本发明公开了一种刺槐的繁殖方法，以不同胚龄的合子胚为外植体，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；以MS基本培养基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-苄氨基腺嘌呤+蔗糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。本发明方法中愈伤组织诱导率、体细胞胚诱导率、萌发率高，可以在短期内形成大量优良的刺槐试管苗，可进行规模化、工厂化生产。
文档编号A01H4/00GK102499086SQ201110340118
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者习洋, 孙宇涵, 孙鹏, 戴丽, 李云, 李允菲, 王欢, 胡瑞阳, 袁存权 申请人:北京林业大学