专利名称：一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的培育方法，属棉花遗传改良与生物技术的应用领域。
背景技术：
棉花是重要的纤维作物和经济作物。在收获产品子棉中，皮棉占40%、种仁占 35 %、种壳占20 %、短绒占5 %。种仁除含有30 % -35 %植物油脂，还含有40 % -43 %优质蛋白。种仁榨油后的棉仁粉中，蛋白质含量高达60%以上，且富含人体必需的8种氨基酸，其蛋白含量和营养组成超过水稻、小麦、玉米和花生等子粒，因此种仁不仅是重要的植物油料来源，而且是世界上仅次于大豆的植物蛋白质资源。然而，目前我国乃至全球大面积栽培的棉花品种主要是有酚棉，其植株体内的棉酚对棉田害虫具有生化抗性，同时种仁中含有的棉酚(gossypol)及其衍生物，人及非反刍动物食用后会损伤其生殖、血管和神经系统， 引起雄性无精子、雌性流产等中毒现象。低酚棉(low gossypol cotton)是一种植株器官中无色素腺体的棉花种质资源，其种仁中的棉酚含量低于联合国粮农组织规定的食用标准 (0. 04% )和国家标准(0. 02% )。低酚棉种仁可直接食用或饲用，以其榨油可生产高品质的食用油，无需精炼，有利于棉子的综合利用。迄今为止，国内外已先后鉴定出gli、gl2、gl3、 gl4、gl5、gl6等6个与腺体形成相关的基因位点，但仅有gl2gl3和Gl2e这两种纯合基因型表现为植株无腺体、种仁低酚。1959年美国McMichael从爱字棉与霍皮棉的杂交后代中首次育成由双隐性基因(gl2gl3)控制的无腺体棉花品种23B，其植株和种子无腺体，种仁可以直接食用。随后世界主产棉国以该无腺体品种作为骨干亲本，通过与优良品种的杂交或回交开展低酚棉育种。传统低酚棉品种的无腺体性状是由两对隐性基因(gl2gl3)控制的，容易受到有酚棉的花粉污染，从而引起低酚棉品种的混杂退化。1966年埃及学者Afifi等通过 32P诱变，培育出第一个显性低酚海岛棉品种Bahtim 110，成为全球显性低酚棉花新品种选育的重要种质资源。遗传研究表明，Bahtim 110无腺体性状受1对不完全显性基因Gl/控制。随后埃及、美国和中国等国通过陆地棉与海岛棉杂交、回交将Bahtim 110显性无腺体性状转育到陆地棉中，育成一系列显性低酚的陆地棉品种(系)。
迄今为止，低酚棉新品种的选育及其应用已有50多年历史，然而低酚棉的推广应用一直未能形成规模。究其原因在于(一)低酚棉品种皮棉产量水平较低，一般比当时推广的有酚品种减产5%左右；(二)棉花植株无色素腺体，缺乏对棉花害虫的抗性；(三)双隐性低酚性状易受有酚品种花粉的污染，种仁食用的安全性受到威胁；(四)低酚棉子棉酚含量低，老鼠危害严重导致种子的繁殖与保存困难；(五)低酚棉种仁的油用、食用功能未能开发，其综合利用的产业链有待培育。然而，缺乏高产、显性无酚、抗虫品种是导致低酚棉无市场竞争力的主要原因之一。棉花聚合育种技术的建立以及高产、显性低酚陆地棉品种 (系)和高强纤维、转Bt基因抗虫棉品种(系)的育成，为选育优质、高产、抗虫、无酚棉花新品种提供了技术支撑和育种亲本。江苏是经济发达省份，近十年来随着子棉收购价格的跌宕起伏，棉花种植面积不断减少，植棉比较效益低严重制约着棉花生产的恢复和发展。江苏3又是纺织工业大省，2007年全省棉纺织工业生产规模和纱线、棉布产量均居我国纺织大省前三位。自2004年以来，江苏省每年纺织用棉量稳定在70万吨以上，按照总需求量的7% 计算非纺织用棉量，全省原棉的年需求量稳定在75万吨以上，然而同期全省皮棉总产仅达到35万吨左右，供需缺口达40万吨以上。选育并推广种植高产、抗虫、无酚棉花新品种，通过开发无酚棉种仁的食用油、食品和保健品功能，大幅度地增加植棉效益，从而提高棉农的植棉积极性，确保我国粮食、原棉和食用油的供给安全。因此，发明一种高效的Bt抗虫基因、GV显性低酚基因的转育、鉴定与选择方法，聚合抗虫、低酚、高产、高强纤维、抗病基因于一体，是本发明的宗旨。发明内容
技术问题
本发明的目的在于针对棉花生产实践中低酚品种易受有酚品种的花粉污染、缺乏对棉田害虫和老鼠的抗性问题，通过遗传改良途径，采用有性杂交并结合标记性状的辅助选择，聚合抗虫、低酚、高产、高强纤维、抗病等优良性状，培育转基因抗棉铃虫、显性低酚棉花新品种，开发利用低酚棉种仁的油用、食用功能，提高植棉经济效益，为棉花成功转变为粮、棉、油兼用型农作物提供品种支撑。
技术方案
本发明的内容是一种转基因抗棉铃虫、种仁无酚棉花的培育方法，其特征在于
1)选用无腺体基因型为Gl2eGl/的高产低酚棉花品种湘棉18号为母本(早)与高强力纤维、抗棉铃虫品系苏76149为父本(3)杂交配组；
2)种植F1群体，成熟期全部单株混收获得F2 ；
3)种植F2、F3、F4，群体种植规模大于300株，三叶期通过对棉苗器官(主茎、子叶、真叶和叶柄)表面有、无色素腺体的鉴定，拔除有腺体棉苗，选择无腺体棉苗；六叶期在幼嫩真叶表面用毛笔点涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后观察叶面是否出现黄白斑，淘汰呈现失绿斑的感卡那霉素植株，保留表现正常绿色的抗卡那霉素植株，成熟后全部单株混收；
4)在种植密度36，000株/公顷条件下，F5开始选择单株结铃数25个以上、平均铃重> 5. 2克、衣分> 39%、抗卡那霉素的无腺体单株；
5)种植F6-F7各世代株系，以感虫有酚品种苏棉22号为对照
室内棉铃虫抗性鉴定。
鉴于田间抗性鉴定易受环境条件的影响，抗虫性鉴定采取室内幼嫩叶片接虫法。 于棉花蕾期在每个待鉴株系和对照品种群体中随机采回20张主茎嫩叶(每株最多采1 片)，每培养皿放2张嫩叶，用脱脂棉包紧叶柄基部保湿，向每个培养皿中接龄期相同的棉铃虫低龄幼虫6头，7 后观察统计死虫数、活虫数、活虫龄期及叶片被害程度等。
参照束春娥等1997年制定的标准，将叶片被害程度分成3个等级，I级受害呈针头状不成片；II级受害成小片，不超过叶面积的1/4 ；III级被害成片，超过叶面积的 1/4。
将抗虫性分成3个等级，高抗幼虫校正死亡率> 80%，叶片被害成I级；中抗 幼虫校正死亡率60%-79%,叶片被害成11级；低抗幼虫校正死亡率< 59%，叶片被害成III级。测定中，若对照组幼虫死亡率> 20%，则必须重新测定。
校正死亡率(％)=处理死亡笟二亡率χ ιοο% V , 100-对照死亡率
选择抗性等级达到高抗、农艺性状稳定的株系。
种仁棉酚含量检测。
成熟期收获植株无腺体、高抗棉铃虫株系子棉，自然晒干后轧花获得棉子。采用夹钳分离棉子壳和种仁，采用“饲料中游离棉酚的测定方法”(国家标准GB/T13086-1991)检测入选株系和对照品种的种仁游离棉酚含量。选择棉酚含量低于无酚棉阈值0. 0004%的株系，即为所获得的转基因抗棉铃虫、种仁无酚棉花的品系。
结合大田棉铃虫自然发生抗性筛选结果，在种植密度36，000株/公顷条件下， F6开始仅在腺体基因型Gl2eGl2e、高抗棉铃虫的小区选择单株结铃数25个以上、平均铃重彡5. 2克、衣分彡39%，且纤维长度彡29mm,比强度彡28c N/tex、马克隆值3. 7-4. 8的单株，获得抗虫、种仁无酚新品系“苏研606”，其株高95-lOOcm，单株结铃数25. 8-27. 2个，铃重5. 4-5. 6克，衣分40. 77% ；纤维长度29. 70mm、比强度30. 6c N/tex、马克隆值4. 5 ；种仁游离棉酚含量0. 000197%，达到无酚棉标准。
有益效果
本发明的优点和效果是
采用高产、显性低酚棉花品种湘棉18号作为亲本之一，育成的抗虫、无酚棉花新品种，其种仁无酚性状受1对显性基因Gl/控制。棉花属虫媒花，2对隐性基因gl2gl3控制的低酚棉品种，如果蜜蜂等昆虫在开花期将有酚品种花粉带到低酚品种柱头上，当代一部分棉子种仁表现有酚，种仁的食用安全性受到影响，随即失去利用价值。而1对显性基因 Gl/控制的低酚棉品种即使受蜜蜂自然传粉的影响，当代棉子种仁仍然表现无酚，克服了双隐性低酚棉品种易受生物学混杂的弊端。
本发明在育种的低世代(F2 F4)群体中，分别采用与转Bt基因抗棉铃虫、种仁无酚密切相关的标记性状抗卡那霉素、植株无腺体进行间接选择，结合南繁加代，能够大幅度地提高选择效率，缩短育种年限。而在育种的高世代(F6 F7)群体中，对基因型已经纯合的两个目标性状转Bt基因抗棉铃虫、种仁无酚直接进行性状鉴定，能够集中精力对少量的株系开展自交纯合、鉴定与选择，实现育种效果的事半而功倍。
本发明方法育成的新品种聚合了杂交亲本双方的高强纤维、高产、抗棉铃虫、种仁无酚、抗病等特性，通过无酚种仁油用、食用和保健用功能的开发以及农药使用量的减少， 能够大幅度地提高植棉经济效益，促进农业增产、农民增收，在广大棉区具有广阔的应用前旦ο
图1收获期抗虫、无酚新品系苏研606 (右)和感虫、有酚品种苏棉22号(左)种仁纵剖面电镜视野中色素腺体(黑点)分布比较。
图2苏研606选育过程具体实施方式
选择亲本
湘棉18号[张雪林，金林，曾昭云等.湘棉18号的选育初报，中国棉花，2000， 27 (10) 18-19]，高产、显性低酚棉花品种，湖南省棉花研究所1995年育成，2000年通过湖南省品种审定定名。该品种全生育期123天，在种植密度36，000株/公顷条件下，株高 100-105cm,单株结铃24. 5-26. 2个，单铃重5. 7克，衣分42. 48 %。纤维上半部平均长度 28. 3mm，断裂比强度29. 3cN/tex，马克隆值5. 1。种仁游离棉酚含量0. 00304%，低于国家食用标准0. 02%，属低酚棉类型。
苏76149[吴巧娟，肖松华，刘剑光等.高品质抗虫棉花新种质的培育，江苏农业科学，2008 (6) :42-44]，高强力纤维、抗棉铃虫棉花品系，江苏省农业科学院经济作物研究所2004年育成并定名。该品系全生育期135天，在种植密度36，000株/公顷条件下，株高95-lOOcm，单株结铃21. 6-23. 8个，单铃重6. 4克，衣分34. 89%。纤维上半部平均长度 32. 6mm,断裂比强度40. OcN/tex,马克隆值4. 2。棉铃虫幼虫校正死亡率86. 05%,叶片被害成I级，高抗棉铃虫。种仁游离棉酚含量0. 35608%，高于国家食用标准0. 02%，属有酚棉类型。
品种选育
2005年夏季在南京选用高产、低酚棉花品种湘棉18号为母本(早)与自育的高强力纤维、抗棉铃虫品系苏76149为父本(3)杂交配组。当年冬季在海南省三亚市中国农业科学院棉花研究所野生棉种植园种植K。2006年春季在南京、当年冬季在三亚、2007年春季在南京分别种植F2、F3、F4，群体规模大于300株，三叶期通过对棉苗器官(主茎、子叶、真叶和叶柄)表面有、无色素腺体的鉴定，拔除有腺体棉苗，选择无腺体棉苗；六叶期在幼嫩真叶表面用毛笔点涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后观察叶面是否出现黄白斑，淘汰呈现失绿斑的感卡那霉素植株，保留表现正常绿色的抗卡那霉素植株，成熟后全部单株混收。2007 年冬季在三亚种植F5,群体规模300株以上，在种植密度36，000株/公顷条件下，成熟期选择单株结铃数25个以上、平均铃重> 5. 2克、衣分> 39%、抗卡那霉素的无腺体单株56个； 单株皮棉样品采用HVI900系列纤维品质测定仪测定纤维品质指标，按照纤维长度> 29mm, 比强度> 28c N/tex、马克隆值3. 7-4. 8的要求，决选获得15个高强纤维、高产、抗卡那霉素、无腺体单株。2008年春季在南京、当年冬季在三亚分别种植F6-F7株系，并以感虫、有酚品种苏棉22号(苏审棉200204)作为对照。
室内棉铃虫抗性鉴定抗虫性鉴定采取室内幼嫩叶片接虫法，于棉花蕾期在每个待鉴株系和对照品种群体中随机采回20张主茎嫩叶，每株最多采1片，每培养皿放2张嫩叶，用脱脂棉包紧叶柄基部保湿，向每个培养皿中接龄期相同的棉铃虫低龄幼虫6头，7 后观察统计死虫数、活虫数、活虫龄期及叶片被害程度；参照束春娥等1997年制定的标准， 将叶片被害程度分成3个等级，I级受害呈针头状不成片；II级受害成小片，不超过叶面积的1/4 ；III级被害成片，超过叶面积的1/4 ；将抗虫性分成3个等级，高抗幼虫校正死亡率> 80%，叶片被害成I级；中抗幼虫校正死亡率60% -79%，叶片被害成II级；低抗 幼虫校正死亡率< 59%，叶片被害成III级，测定中，若对照组幼虫死亡率> 20%，则必须重新测定，选择抗性等级达到高抗株系
6校正死亡种/。)=处理死亡亡率χ画100-对照死亡率
种仁棉酚含量检测成熟期收获高抗棉铃虫的植株无腺体株系子棉，自然晒干后轧花获得棉子，采用夹钳分离棉子壳和种仁，采用国家标准GB/T13086-1991“饲料中游离棉酚的测定方法”检测入选株系和对照品种的种仁游离棉酚含量，选择棉酚含量低于无酚棉阈值0. 0004%的株系，获得转基因抗棉铃虫、种仁无酚棉花的新品系6个。
2009年春季以抗虫、无酚新品系和苏棉22号为供试材料，在江苏省徐淮、沿海、沿江棉区进行多点试验，通过对产量、纤维品质、抗虫、抗病和种仁棉酚含量等性状的鉴定，获得高强纤维、高产、抗虫、无酚棉花优良品系苏研606。
通过以上方法育成的转基因抗棉铃虫、种仁无酚棉花新品系“苏研606”，棉铃虫幼虫校正死亡率89. 67 %，叶片被害成I级，高抗棉铃虫。种仁棉酚含量0. 000197 %，远低于国家食用标准0. 02%，达到无酚棉标准。在种植密度36，000株/公顷条件下，株高95-lOOcm， 单株结铃数25. 8-27. 2个，铃重5. 4-5. 6克，衣分40. 77% ；纤维上半部平均长度29. 70mm、 断裂比强度30. 6c N/tex、马克隆值4. 5。
权利要求
1.一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的培育方法，其特征在于1)选用无腺体基因型为G1/GV的高产、低酚棉花品种湘棉18号为母本早，与高强力纤维、抗棉铃虫品系苏76149为父本J杂交配组；2)种植F1群体，成熟期全部单株混收获得F2；3)种植F2、F3、F4，群体种植规模大于300株，三叶期通过对棉苗器官主茎、子叶、真叶和叶柄表面有、无色素腺体的鉴定，拔除有腺体棉苗，选择无腺体棉苗；六叶期在幼嫩真叶表面用毛笔点涂2000ppm卡那霉素溶液，一周后观察叶面是否出现黄白斑，淘汰呈现失绿斑的感卡那霉素植株，保留表现正常绿色的抗卡那霉素植株，成熟后全部单株混收；4)在种植密度36，000株/公顷条件下，F5选择单株结铃数25个以上、平均铃重>5. 2 克、衣分> 39%、抗卡那霉素的无腺体单株；5)种植F6-F7各世代株系，以感虫有酚品种苏棉22号为对照室内棉铃虫抗性鉴定抗虫性鉴定采取室内幼嫩叶片接虫法，于棉花蕾期在每个待鉴株系和对照品种群体中随机采回20张主茎嫩叶，每株最多采1片，每培养皿放2张嫩叶，用脱脂棉包紧叶柄基部保湿，向每个培养皿中接龄期相同的棉铃虫低龄幼虫6头，72h后观察统计死虫数、活虫数、活虫龄期及叶片被害程度；参照束春娥等1997年制定的标准，将叶片被害程度分成3个等级，I级受害呈针头状不成片；II级受害成小片，不超过叶面积的1/4 ；III级被害成片，超过叶面积的1/4 ；将抗虫性分成3个等级，高抗幼虫校正死亡率> 80%，叶片被害成I级；中抗幼虫校正死亡率60% -79%，叶片被害成II级；低抗幼虫校正死亡率< 59%，叶片被害成III 级校正死亡率(％)=处理死亡f=，亡率X100%100-对照死亡率选择抗性等级达到高抗的株系；种仁棉酚含量检测成熟期收获植株无腺体、高抗棉铃虫株系子棉，获得棉子，采用国家标准GB/ T13086-1991 “饲料中游离棉酚的测定方法”检测入选株系种仁游离棉酚含量，选择棉酚含量低于无酚棉阈值0. 0004%的株系，即为所获得的转基因抗棉铃虫、种仁无酚棉花的品系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在种植密度36，000株/公顷条件下，F5同时选择结铃数25个以上、平均铃重> 5. 2克、 衣分彡39%、纤维长度彡29mm,比强度彡28c N/tex、马克隆值3. 7-4. 8、抗卡那霉素的无腺体单株。
全文摘要
本发明涉及一种转基因抗棉铃虫和种仁无酚棉花的育种方法，属于棉花育种领域。选用无腺体基因型为Gl2eGl2e的高产、低酚棉花品种湘棉18号为母本♀与高强力纤维、抗棉铃虫品系苏76149为父本♂杂交配组获得。本发明能够快速聚合高强纤维、高产、抗病与转Bt基因抗虫、显性无酚性状，显著地提高了选择效率，缩短育种年限。育成棉花新品种不仅对棉铃虫、老鼠表现稳定抗性，减少棉铃虫防治用药2~3次，降低生产成本，棉种贮运安全可靠；因不含棉酚及其类似物，种仁可作为人类食用油、食品和保健品的加工原料，每亩可为棉农增加经济收入1750元，在我国广大棉区具有广阔的推广应用前景。
文档编号A01H1/02GK102499060SQ201110340099
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者刘剑光, 吴巧娟, 狄佳春, 肖松华, 许乃银, 赵君, 陈旭升, 马晓杰 申请人:江苏省农业科学院