专利名称：一种可直接移栽的铁皮石斛育苗方法
技术领域：
本发明涉及一种组培方法，尤其是针对铁皮石斛的组培方法，属于生物技术领域。
背景技术：
石斛属植物中有不少是名贵中药，在《本草纲目》中石斛被列为上品。我国76种石斛属植物中有近40种作药用，著名的有金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛等，具有强阴益精、 补肾益力、轻生延年等作用，其药用与保健功能日益被挖掘，其应用范围正迅速扩大。同时， 石斛属植物约有四分之一可供观赏，以花艳丽而著称，近年作为观赏植物发展迅速，已形成独立产业。鉴于集药用和观赏于一体的价值，使之过度的采伐利用，加之其本体自然繁殖率低，造成了石斛供需之间的紧张状况，我国已将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之一。自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来，石斛组织培养技术逐步深化，尤其近年来石斛组织培养育苗逐步趋向产业化，石斛组织培养的最佳条件，包括适宜的光照、温度、湿度、PH以及如何选用外植体，如何配置营养适宜的培养液等都取得长足进展。但是通过传统的石斛组培方法，特别是铁皮石斛组培方法培育出来的苗种由于还不够壮实，生命力较弱，因此在移栽到自然环境中前都需要在大棚内进行3-5个月的训化(炼苗)，而且其移栽后的生长周期较长，造成育苗成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种组培苗无需训化，而可直接移栽的铁皮石斛组培方法，提高了铁皮石斛组培苗的扩繁速度、生产质量、移栽成活率，并缩短了移栽后铁皮石斛的生长周期，提升了成年石斛的质量。为解决上述问题，本发明的铁皮石斛育苗方法包括下列步骤
1)将铁皮石斛的蒴果种子经消毒后，播入专用培养基I+专用组培杯+专用培养室里， 进行萌发培养，培养温度为M-26°C，湿度为65-75%，光照度为1000-20001X，光照时间为 10-12小时/日，培养45-60天，外植体萌芽形成绿色的原球茎；
2)将原球茎转入专用培养基II+专用组培杯+专用培养室里，进行原球茎增殖、分化培养，培养温度为2248°C，湿度为65-75%，光照度为1500_25001x，光照时间为10-12小时/ 日，培养60天，由原球茎培育成1-2CM小苗，同时伴随着有部分新原球茎产生，再将小苗转入同样的组培杯、培养基和环境下继续培养1个月，将小苗培养成中苗，苗高为34cm ；
3)将中苗转入专用培养基III+专用组培杯+专用培养室里，培养温度为20-30°C，湿度为65-75%，光照度为2000-40001x，光照时间为10-12小时/日，培养60天，由小苗培育成高为5-9CM，茎粗为0. 4-0. 5CM的壮苗；
所述专用培养基I包括1/2MS基本培养基+芋头汁15-25% (V/V)+琼脂4_6g/L，PH值为 5. 2-5. 8 ；
所述专用培养基II包括MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 1-0. 2mg/L+琼脂 4-6g/L+ 土豆汁 6-10% (V/V) + 香蕉汁 10-14% (V/V)，PH 值为 5. 4-5. 8 ；所述专用培养基III包括MS基本培养基+ NAA (α-萘乙酸)0. l-0.2mg/L+香蕉汁
8-10%(V/V) + 土豆汁 5-7% (V/V) + 芋头汁 8-12% (V/V) + 琼脂 4_6g/L，PH 值为 5. 4-5. 8 ； 所述专用组培杯为具有适度空间容积的透明的塑料杯体，所述塑料杯体杯口通过透明
的塑料膜塑封，所述塑料膜上设置滤膜；
所述专用培养室为灭菌培养室，所述灭菌室采用自然光照，其顶端设置采光瓦和遮阳网，并设有温度湿度调节设备。本发明的进一步优化方案，其特征在于所述塑料杯体为圆柱形，杯口直径为
9-10cm,杯底直径为5-6cm,杯高为 9-lOcm，壁厚 0. 15-0. 25mm。所述的组培苗可直接移栽的铁皮石斛组培方法，其特征在于所述专用培养基I包括1/2MS基本培养基+芋头汁20%(V/V) +琼脂5g/L，PH值为5. 5。所述的组培苗可直接移栽的铁皮石斛组培方法，其特征在于所述专用培养基II包括MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 15mg/L+琼脂5g/L+ 土豆汁8% (V/V) +香蕉汁 12%(V/V), PH 值为 5.5。所述的组培苗可直接移栽的铁皮石斛组培方法，其特征在于所述专用培养基III包括MS基本培养基+NAA ( α -萘乙酸)0. 15mg/L+香蕉汁9% (V/V) + 土豆汁6% (V/V) +芋头汁 10%(V/V) + 琼脂 5g/L，PH 值为 5. 5。本发明改进了现有的培养基配方，满足了组培苗在各个生长阶段对各种营养成份的需要与均衡，独创了具有透光性能好，感染率低空气充足的专用组培杯，并提供清洁适宜的自然光环境，在三者的共同作用下，可以由一棵铁皮石斛的蒴果种子通过7-8个月的组织培养，培育出20万株的石斛组培苗，该组培苗无需传统的3-5个月的训化过程，可直接移栽到室外，移栽成活率在98%上以。本发明方法不仅提高了铁皮石斛组培苗的扩繁速度、生产质量、移栽成活率，而且有效地缩短了铁皮石斛大棚培育时间，提升成年铁皮石斛的品质，这对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用有着十分积极的意义。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1为本发明专用组培杯的结构示意图。图中1-透明塑料杯、2-塑料膜塑封、3-滤膜。
具体实施例方式实施例1。第1阶段，将成熟壮实的铁皮石斛的蒴果种子经消毒后，在一个无菌的环境中，将其播入内装有1/2MS基本培养基+芋头汁15%(V/V) +琼脂4g/L的培养基的透明塑料杯体 1里进行萌发培养，塑料杯体1杯口通过透明的塑料膜2塑封，塑料膜2上设置滤膜3。最后送入灭菌培养室里培养，灭菌室屋采用自然光照，其顶设置采光瓦和遮阳网层，内部设有温度湿度调节设备。培养温度为M_26°C，湿度为65-75%，光照度为1000-20001χ，光照时间为10-12小时/日，培养45-60天，外植体萌芽形成绿色的原球茎。第2阶段，将原球茎在一个无菌的环境中，将其转入内装有MS基本培养基+
4BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. lmg/L+琼脂4g/L+ 土豆汁6% (V/V) +香蕉汁10% (V/V)的培养基的透明塑料杯体1里进行原球茎增殖、分化培养，塑料杯体1杯口通过透明的塑料膜2塑封， 塑料膜2上设置滤膜3。最后送入无菌培养室里培养，无菌室屋顶设置采光瓦和遮阳网层， 培养温度为2248°C，湿度为65-75%，光照度为1500_25001x，光照时间为10-12小时/日， 培养60天，由原球茎培育成1-2CM小苗，同时伴随着有部分新原球茎产生，再将小苗转入同样的组培杯、培养基和环境下继续培养1个月，将小苗培养成中苗，苗高为34cm。第3阶段，将中苗在一个无菌的环境中，将其转入内装有转入MS基本培养基+ NAA ( α -萘乙酸)0. lmg/L+ 香蕉汁 8% (V/V) + 土豆汁 6% (V/V) + 芋头汁 8% (V/V) + 琼脂 4g/ L的培养基的透明塑料杯体1里进行壮苗培养，塑料杯体1杯口通过透明的塑料膜2塑封， 塑料膜2上设置滤膜3。最后送入无菌培养室里培养，无菌室屋采用自然光照，其顶设置采光瓦和遮阳网层，培养温度为20-30°C，湿度为65-75%，光照度为2000-40001x，光照时间为 10-12小时/日，培养60天，由小苗培育成高为5-9CM，茎粗为0. 4-0. 5CM的壮苗。进一步优化方法，上述步骤中，培养基的PH值在5. 4，塑料杯体1为柱形，杯口直径为9-10cm，杯底直径为5-6cm，杯高为9-lOcm，壁厚0. 15-0. 25mm时，最为适宜。实施例2
在实施例1中，当专用培养基I配方体积比为1/2MS基本培养基+芋头汁25%(V/V) +琼脂6g/L，PH值为5. 8或为1/2MS基本培养基+芋头汁20% (V/V) +琼脂5g/L，PH值为5. 5 ； 或专用培养基II配方体积比为MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 2mg/L+琼脂 6g/L+ 土豆汁10% (V/V) +香蕉汁14% (V/V)，PH值为5. 8或为MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 15mg/L+琼脂5g/L+ 土豆汁8%(V/V) +香蕉汁12%(V/V)，PH值为5. 5 ；
或专用培养基III配方体积比为MS基本培养基+ NAA (α-萘乙酸)0.2mg/L+香蕉汁 10% (V/V) + 土豆汁7% (V/V) +芋头汁12% (V/V) +琼脂6g/L，PH值为5. 8或为MS基本培养基 + NAA (α -萘乙酸)0. 15mg/L+ 香蕉汁 9% (V/V) + 土豆汁 6% (V/V) + 芋头汁 10% (V/V) + 琼脂5g/L，PH值为5. 5时，也能达到实施例1的效果。 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种可直接移栽的铁皮石斛育苗方法，其特征在于该育苗方法包括下列步骤1)将铁皮石斛的蒴果种子经消毒后，播入专用培养基I+专用组培杯+专用培养室里， 进行萌发培养，培养温度为M-26°C，湿度为65-75%，光照度为1000-20001X，光照时间为 10-12小时/日，培养45-60天，外植体萌芽形成绿色的原球茎；2)将原球茎转入专用培养基II+专用组培杯+专用培养室里，进行原球茎增殖、分化培养，培养温度为2248°C，湿度为65-75%，光照度为1500_25001x，光照时间为10-12小时/ 日，培养60天，由原球茎培育成1-2CM小苗，同时伴随着有部分新原球茎产生，再将小苗转入同样的组培杯、培养基和环境下继续培养1个月，将小苗培养成中苗，苗高为34cm ；3)将中苗转入专用培养基III+专用组培杯+专用培养室里，培养温度为20-30°C，湿度为65-75%，光照度为2000-40001x，光照时间为10-12小时/日，培养60天，由小苗培育成高为5-9CM，茎粗为0. 4-0. 5CM的壮苗；所述专用培养基I包括1/2MS基本培养基+芋头汁15-25% (V/V)+琼脂4-6g/L，PH值为 5. 2-5. 8 ；所述专用培养基II包括MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 1-0. 2mg/L+琼脂 4-6g/L+ 土豆汁 6-10% (V/V) + 香蕉汁 10-14% (V/V)，PH 值为 5. 4-5. 8 ；所述专用培养基III包括MS基本培养基+ NAA (α-萘乙酸)0. l-0.2mg/L+香蕉汁 8-10% (V/V) + 土豆汁 5-7% (V/V) + 芋头汁 8-12% (V/V) + 琼脂 4_6g/L，PH 值为 5. 4-5. 8 ；所述专用组培杯为具有适度容积的透明的塑料杯体(1)，所述塑料杯体(1)杯口通过透明的塑料膜(2 )塑封，所述塑料膜(2 )上设置滤膜(3 )；所述专用培养室为灭菌培养室，所述灭菌室采用自然光照，其顶端设置采光瓦和遮阳网，内部设有温度湿度调节设备。
2.根据权利要求1所述的可直接移栽的铁皮石斛育苗方法，其特征在于所述塑料杯体 (1)为柱形，杯口直径为9-10cm,杯底直径为5-6cm,杯高为9-lOcm，壁厚0. 15-0. 25mm。
3.根据权利要求1所述的可直接移栽的铁皮石斛育苗方法，其特征在于所述专用培养基I包括1/2MS基本培养基+芋头汁20%(V/V) +琼脂5g/L，PH值为5. 5。
4.根据权利要求1所述的可直接移栽的铁皮石斛育苗方法，其特征在于所述专用培养基II包括MS基本培养基+ BA (6-卞氨基腺嘌呤)0. 15mg/L+琼脂5g/L+ 土豆汁8% (V/V) + 香蕉汁12%(V/V)，PH值为5. 5。
5.根据权利要求1所述的可直接移栽的铁皮石斛育苗方法，其特征在于所述专用培养基III包括MS基本培养基+NAA ( α -萘乙酸)0. 15mg/L+香蕉汁9% (V/V) + 土豆汁6% (V/V) +芋头汁10%(v/v) +琼脂5g/L，PH值为5. 5。
全文摘要
本发明涉及一种组培方法，尤其是针对铁皮石斛的组培方法，属于生物技术领域。要解决的技术问题是提供一种组培苗可直接移栽的铁皮石斛组培方法。为解决上述问题，本发明改进了现有的培养基配方，独创了具有透光性能好，感染率低空气充足的专用组培杯，并提供清洁适宜的自然光环境，在三者的共同作用下，可以由一棵铁皮石斛的蒴果种子通过7-8个月的组织培养，培育出20万株的石斛组培苗，该组培苗无需传统的3-5个月的训化(炼苗)过程，可直接移栽到室外，移栽成活率在98%上以。
文档编号A01H4/00GK102499085SQ20111033281
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者章亚辉, 章纪海 申请人:乐清市鼎元生物科技有限公司