专利名称：一种辽东楤木原生质体培养方法
技术领域：
本发明涉及一种辽东橡木原生质体培养方法。
背景技术：
辽东橡木[Aralia elates (Miq. ) kem]是一种食药兼用型经济植物，主要分布于中国东北地区。辽东橡木的食药用价值较高，其嫩芽含有丰富的营养成分；其植株根、茎、叶等器官均含有多种橡木皂苷，主要皂苷元为齐墩果酸类化合物，可作为生产中药制剂的原料。原生质体具有细胞全能性，能够再生细胞壁并进行细胞分裂并再生成完整植株。 辽东橡木原生质体的培养可为进一步筛选橡木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。目前关于辽东橡木相关报道研究均在外植体再生愈伤组织、植株再生方面，现今尚未见到利用辽东橡木的愈伤组织、叶片等来源的原生质体培养及植株再生的相关报道。
发明内容
本发明提供一种辽东橡木原生质体培养方法，可为进一步筛选橡木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养，以及为以原生质体为受体材料进行的各种遗传分析与操作提供基础材料。本发明辽东橡木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、取培养20 30天的辽东橡木无菌苗叶片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封，于2 6°C暗处理 6 他；二、再将无菌苗叶片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23 27°C暗处理2 14h，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经MO目筛网过滤，再以1500r/min离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min离心 lmin，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤2 3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混勻后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25°C、60 80r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养13 17天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东橡木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有 1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和质量浓度3%蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、质量浓度3%蔗糖和6. 5g/L琼脂的MS培养基。本发明操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，原生质体的活性为80. 5% 87. 7%，产量为1. 0 3. 2X IO7个/g。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达95%以上。本发明着重于探索影响原生质体分离和培养的因素，完善原生质体稳定高效的分离与培养体系，以提高原生质体培养的重复性，使原生质体培养更为简单化和实用化。以此获取的大量高活性原生质体及诱导的愈伤组织可以满足橡木皂苷高产细胞系筛选培育和细胞融合等实验的需要。
图1为具体实施方式
二十八得到的原生质体的形态照片；图2为具体实施方式
二十八中原生质体培养过程中形成的细胞；图3为具体实施方式
二十八中原生质体培养过程中形成的细胞团。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式辽东橡木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、 取培养20 30天的辽东橡木无菌苗叶片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封， 于2 6°C暗处理6 他；二、再将无菌苗叶片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封， 于23 27°C暗处理2 14h，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经MO目筛网过滤，再以1500r/min离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以 500r/min离心lmin，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤2 3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混勻后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25°C、60 80r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养13 17天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东橡木原生质体培养方法；其中步骤四所述培养基为含有1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和质量浓度3%蔗糖的MS培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、质量浓度3%蔗糖和6. 5g/L 琼脂的MS培养基。本实施方式所述CPW 溶液由 101mg/L 的 KN03、27. 2mg/L 的 KH2P04、0. 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20,246mg/L 的 MgSO4 · 7Η20、0· 16mg/L 的 ΚΙ、1. 48mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和蒸馏水组成，CPW溶液的pH值为5.8。本实施方式中BA为苄氨基嘌呤，6-BA为6_苄氨基嘌呤，NAA为a_萘乙酸。本实施方式操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，原生质体的活性为80. 5% 87. 7%，产量为1. O 3. 2 X IO7个/g。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达95%以上。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中于2°C暗处理。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中于6°C暗处理。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中于3 5°C暗处理。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中于4°C暗处理。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中暗处理他。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中暗处理他。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中暗处理几。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤二所述酶解液为含有质量浓度2%的纤维素酶(Cellulase R-10)和质量浓度0. 4%的离析酶 (MacerozymeR-IO)的CPW溶液。其它与具体实施方式
一至八之一相同。本实施方式所述CPW 溶液由 101mg/L 的 KN03、27. 2mg/L 的 KH2P04、0. 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20,246mg/L 的 MgSO4 · 7Η20、0· 16mg/L 的 ΚΙ、1. 48mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和蒸馏水组成，CPW溶液的pH值为5.8。本实施方式的酶解液使用前需要经过0. 22 μ m混合纤维素微孔滤膜过滤除菌，其 pH 为 5.8。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中于 23 °C暗处理。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中于27°C暗处理。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤二中于25°C暗处理。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中暗处理池。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中暗处理14h。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中暗处理4 12h。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中暗处理6 10h。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一至十二之一不同的是步骤二中暗处理他。其它与具体实施方式
一至十二之一相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
一至十七之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到750mmol/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式
一至十七之一相同。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
一至十七之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到900mmol/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式
一至十七之一相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
一至十七之一不同的是步骤三中将所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中。其它与具体实施方式
一至十七之一相同。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
一至二十之一不同的是步骤四中在25°C、60r/min条件下进行暗培养。其它与具体实施方式
一至二十之一相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
一至二十之一不同的是步骤四中在25°C、80r/min条件下进行暗培养。其它与具体实施方式
一至二十之一相同。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施方式
一至二十之一不同的是步骤四中在25°C、70r/min条件下进行暗培养。其它与具体实施方式
一至二十之一相同。
具体实施方式
二十四本实施方式与具体实施方式
一至二十三之一不同的是步骤四中培养13天。其它与具体实施方式
一至二十三之一相同。
具体实施方式
二十五本实施方式与具体实施方式
一至二十三之一不同的是步骤四中培养17天。其它与具体实施方式
一至二十三之一相同。
具体实施方式
二十六本实施方式与具体实施方式
一至二十三之一不同的是步骤四中培养14 16天。其它与具体实施方式
一至二十三之一相同。
具体实施方式
二十七本实施方式与具体实施方式
一至二十三之一不同的是步骤四中培养15天。其它与具体实施方式
一至二十三之一相同。
具体实施方式
二十八本实施方式辽东橡木原生质体培养方法，按以下步骤进行 一、取培养30天的辽东橡木无菌苗顶部叶片lg，放入20mL含有600mmol/L甘露醇的CPW 溶液中密封，于4°C暗处理；二、再将无菌苗叶片放入IOmL含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于25°C暗处理8，得混合液；三、将混合液经MO目筛网过滤，再以1500r/min 离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min离心lmin， 然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入5mLCPW溶液中洗涤3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混勻后加入到培养皿中，将培养皿用 Paraf i Im膜封口，再将培养皿放入摇床中，在25°C、70r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养15天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东橡木原生质体培养方法。原生质体活性测定采用曲利本蓝染色法，原生质体活性及原生质体产量的计算公式如下原生质体活性=未被染色的原生质体数(有活性)/原生质体总数X100%。原生质体产量(个/g)=原生质体总数(个)/材料鲜重(g)本实施方式制备的原生质体具有鲜艳的颜色，形态较圆且透明，如图1所示。图2 为原生质体培养过程中形成的细胞，图3为原生质体培养过程中形成的细胞团。本实施方式原生质体的活性为84. 13%，产量为2. 12 X IO7个/g。原生质体培养过程中细胞增殖较快，形成的微型愈伤组织活力高，生长迅速，转接到固体培养基上成活率可达97%。
权利要求
1.一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于辽东橡木原生质体培养方法，按以下步骤进行一、取培养20 30天的辽东橡木无菌苗叶片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW 溶液中密封，于2 6°C暗处理6 他；二、再将无菌苗叶片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23 27°C暗处理2 14h，得混合液；三、将步骤二得到的混合液经MO目筛网过滤，再以1500r/min离心3min，去掉上清，将所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min离心lmin，然后用吸管将处于离心管中部的原生质体带吸出，放入 CPW溶液中洗涤2 3次，得到纯化后的原生质体；四、将纯化后的原生质体放入培养基中混勻后加入到培养皿中，将培养皿封口，再将培养皿放入摇床中，在25°C、60 80r/min条件下进行暗培养，每隔3天更换一次培养基，培养13 17天后，获得微小愈伤组织；五、将微小愈伤组织移植到芽分化培养基中培养，诱导成苗，即完成辽东橡木原生质体培养方法； 其中步骤四所述培养基为含有1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和质量浓度3%蔗糖的MS 培养基；步骤五所述芽分化培养基为含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、质量浓度3%蔗糖和6. 5g/L琼脂的MS培养基。
2.根据权利要求1所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于 3 5°C暗处理。
3.根据权利要求1所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中于 4°C暗处理。
4.根据权利要求1或2所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤一中暗处理7h。
5.根据权利要求4所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中于 25 °C暗处理。
6.根据权利要求5所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理4 12h。
7.根据权利要求5所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤二中暗处理8h。
8.根据权利要求6所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤三中将所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中。
9.根据权利要求8所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中在 25°C、70r/min条件下进行暗培养。
10.根据权利要求9所述的一种辽东橡木原生质体培养方法，其特征在于步骤四中培养15天。
全文摘要
一种辽东楤木原生质体培养方法，涉及一种辽东楤木原生质体培养方法。本发明可为进一步筛选楤木皂苷高产细胞及细胞系、开展细胞融合与再生植株培养提供基础材料。方法取辽东楤木无菌苗叶片，放入含甘露醇的CPW溶液中密封，暗处理；将无菌苗叶片放入含甘露醇的酶解液中密封，暗处理；过滤，离心去上清，将沉淀加入蔗糖溶液中，离心，将原生质体带吸出，放入CPW溶液中洗涤；放入培养基中混匀后加入到培养皿中，再放入摇床暗培养，获得微小愈伤组织；然后移植到芽分化培养基，诱导成苗，即完成辽东楤木原生质体培养方法。本发明操作简便，设备要求低，污染率极低，制备的原生质体颜色鲜艳，形态较圆且透明，原生质体的活性高，产量高。
文档编号A01H4/00GK102349444SQ20111022743
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者徐正莉, 李富恒, 赵恒田, 邓中枢, 黄福山 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所