专利名称：多倍体香石竹种质的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种多倍体植物的育种方法，尤其是涉及一种利用2η配子和胚培养培育多倍体香石竹种质的方法，属于植物遗传育种技术领域。
背景技术：
多倍体植物因其花大、花色浓艳、茎杆粗壮等特点而具有重要的观赏价值。此外， 多倍体也是克服远缘杂交当代不孕和远缘杂种不结实的一个重要方法。2η配子杂交被认为是目的性状基因渐渗非常有效的途径，有利于不同倍性的种质渗入和基因流动，且杂交后代具有更广泛的遗传变异，杂交后代的性状也很稳定。因此，利用2η配子创新具有高度杂合性和丰富遗传异质性的多倍体杂种群体具有重要的意义。香石竹(Dianthus Caryophyllus Lirm)，又名麝香石竹、康乃馨，为多年生草本植物。它具有品位高、色彩丰富、芳香、花期长、装饰效果好等特点，是目前世界上应用最普遍的花卉之一，是世界重要切花种类之一，也是中国、云南省最重要的出口花卉之一。香石竹父母本不同倍性间杂交获得的合子胚往往在早期发育阶段就败育或退化，降低了育种效率。而通过离体培养可使胚在适宜的离体培养条件下获得再生植株。因此，用离体培养来挽救胚的方法，在植物育种中具有十分重要的理论与实践意义。
发明内容
为解决香石竹遗传背景狭窄，种质资源大都为二倍体，同时不同倍性香石竹品种杂交过程出现受精前的不亲和性，导致胚败育或退化等问题，本发明提供一种利用2η配子和胚培养技术创新多倍体香石竹种质资源的方法。本发明提供的是这样一种多倍体香石竹种质的培育方法，其特征在于经过下列步骤
Α.选择四倍体种质作为母本，二倍体种质作为父本，在盛花期去雄并套袋，7 14天后进行人工授粉，授粉15 45天后去袋剥取子房；
B.将步骤A剥取的子房进行消毒处理后，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种在下列胚培养基上MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天，温度为23 27°C条件下，培养20 60天，使白色的胚珠长大变成黑色的种子；
C.将步骤B的黑色种子的种皮切开，剥取白色的胚，继续在下列胚培养基中 MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天， 温度为23 27°C条件下，培养20 60天；
D.将步骤C所得的成活的胚接种在下列继代培养基上MS+0.05 0.5mg/L的 ΒΑ+0. 01 0. 3mg/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天，温度为22 的条件下，培养20 40天，即得到多倍体香石竹植株。所述步骤A中的四倍体种质为柱头亲合性较强的四倍体种质，且柱头的最佳可授期为柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛；所述步骤A中的二倍体种质是与四倍体种质具有互补优良性状且产生2η配子的二倍体种质，2η配子的产生频率为大于或等于 0.01%，人工授粉时选择刚散粉的父本花粉，此时采集的花粉量大、花粉活力高。所述步骤B的消毒处理是用体积浓度为70%的酒精消毒20 60s，再用质量浓度为0. 1 0. 2%的升汞消毒20 60min，无菌水冲洗3 4次。本发明具有下列优点和效果人工理化诱变的多倍体，存在嵌合体较高，诱变效率较低、处理易产生危害等缺点；而通过2η配子杂交结合胚培养技术获得的多倍体，可克服由于体细胞加倍等无性多倍化而导致的杂种育性和生活力下降的问题，且是目的性状基因渐渗非常有效的途径，有利于不同倍性的种质渗入和基因流动，杂交后代具有更广泛的遗传变异，杂交后代的性状也很稳定。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1
Α.选择多头香石竹种质资源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)为母本，其花色、花形独特，生育期短，且组培苗繁殖能力强，繁殖系数高，但育性低，抗病性弱，为枯萎病易感品种；以单瓣选择系NHlO (2η=2χ=30)为父本，其具有很高育性，产量高，抗病性强，2η配子产生频率大于 0. 01%，在盛花期，母本去雄并套袋，套袋后10天，母本柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛时，采集刚散粉的父本花粉，此时花粉量大、花粉活力高，进行人工授粉，授粉15天后去袋剥取子房；
B.将步骤A剥取的子房，用体积浓度为70%的酒精消毒30s，再用质量浓度为0.2%的升汞消毒40min，无菌水冲洗3次，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种于下列胚培养基上 MS+0. 01mol/L的NAA，在光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，温度为25°C条件下， 培养30天，白色的胚珠长大变成黑色的种子；
C.将步骤B的黑色种子的种皮切开，剥取白色的胚，继续于下列胚培养基中 MS+0. 01mol/L的NAA，在光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，温度为25°C条件下， 培养40天；
D.将步骤C所得的成活的胚接种在下列继代培养基上MS+0.5mg/L的BA+0. 3mg/L的 NAA，在光照强度为20001x，光照时间为8小时/天，温度为25°C的条件下，培养30天，即得到多倍体香石竹植株。胚的成苗率为1. 8%，获得一棵植株，染色体倍性鉴定为四倍体。实施例2
A.选择多头香石竹种质资源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)为母本，其花色、花形独特，生育期短，且组培苗繁殖能力强，繁殖系数高，但育性低，抗病性弱，为枯萎病易感品种；以单瓣选择系NHlO (2η=2χ=30)为父本，其具有很高育性，产量高，抗病性强等特点，2η配子产生频率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后12天，母本柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛时，采集刚散粉的父本花粉，此时花粉量大、花粉活力高，进行人工授粉，授粉 21天后去袋剥取子房
B.将步骤A剥取的子房，用体积浓度为70%的酒精消毒60s，再用质量浓度为0.2%的升汞消毒30min，无菌水冲洗3次，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种于下列胚培养基上 MS+0. 2mol/L的NAA，在光照强度为20001x，光照时间为10小时/天，温度为25°C条件下， 培养40天，使白色的胚珠长大变成黑色的种子；
C.将步骤B的黑色种子的种皮切开，剥取白色的胚，继续于下列胚培养基中 MS+0. 2mol/L的NAA，在光照强度为20001x，光照时间为10小时/天，温度为25°C条件下， 培养50天；
D.将步骤C所得的胚接种在下列继代培养基上MS+0.3mg/L的BA+0. lmg/L的NAA，在光照强度为20001x，光照时间为10小时/天，温度为25°C的条件下，培养25天，即得到多
倍体香石竹植株。胚的成苗率为1. 3%，获得一棵植株，染色体倍性鉴定为四倍体。实施例3
A.选择多头香石竹种质资源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)为母本，其花色、花形独特，生育期短，且组培苗繁殖能力强，繁殖系数高，但育性低，抗病性弱，为枯萎病易感品种；以单瓣选择系NH14(2n=h=30)为父本，其具有很高育性，产量高，抗病性强等特点，2η配子产生频率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后7天，母本柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛时，采集刚散粉的父本花粉，此时花粉量大、花粉活力高，进行人工授粉，授粉45 天后去袋剥取子房；
B.将步骤A剥取的子房，用体积浓度为70%的酒精消毒20s，再用质量浓度为0.1%的升汞消毒60min，无菌水冲洗4次，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种于下列胚培养基上 MS+0. 6mol/L的NAA，在光照强度为15001x，光照时间为12小时/天，温度为23°C条件下， 培养20天，使白色的胚珠长大变成黑色的种子；
C.将步骤B的种子皮切开，剥取白色的胚，继续于下列胚培养基中MS+0.6mol/L的 NAA，在光照强度为15001x，光照时间为12小时/天，温度为27°C条件下，培养20天；
D.将步骤C所得的胚接种在下列继代培养基上MS+0.05mg/L的BA+0. 0lmg/L的NAA， 在光照强度为15001x，光照时间为12小时/天，温度为的条件下，培养20天，即得到多倍体香石竹植株。胚的成苗率为2. 3%，获得一棵植株，染色体倍性鉴定为四倍体。实施例4
A.选择多头香石竹种质资源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)为母本，其花色、花形独特，生育期短，且组培苗繁殖能力强，繁殖系数高，但育性低，抗病性弱，为枯萎病易感品种；以单瓣选择系ΝΗ14 (2η=2χ=30)为父本，其具有很高育性，产量高，抗病性强等特点，2η配子产生频率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后14天，母本柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛时，采集刚散粉的父本花粉，此时花粉量大、花粉活力高，进行人工授粉，授粉 30天后去袋剥取子房；
B.将步骤A剥取的子房，用体积浓度为70%的酒精消毒40s，再用质量浓度为0.1%的升汞消毒20min，无菌水冲洗4次，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种于下列胚培养基上 MS+0. 4mol/L的NAA，在光照强度为18001x，光照时间为9小时/天，温度为27°C条件下，培养60天，使白色的胚珠长大变成黑色的种子；
C.将步骤B的种子皮切开，剥取白色的胚，继续于下列胚培养基中MS+0.2mol/L的NAA，在光照强度为18001x，光照时间为12小时/天，温度为23°C条件下，培养60天；
D.将步骤C所得的胚接种在下列继代培养基上MS+0. 2mg/L的BA+0. 2mg/L的NAA，在光照强度为18001x，光照时间为8小时/天，温度为22°C的条件下，培养40天，即得到多倍体香石竹植株。 胚的成苗率为2. 6%，获得一棵植株，染色体倍性鉴定为四倍体。
权利要求
1.一种多倍体香石竹种质的培育方法，其特征在于经过下列步骤A.选择四倍体种质作为母本，二倍体种质作为父本，在盛花期去雄并套袋，7 14天后进行人工授粉，授粉15 45天后去袋剥取子房；B.将步骤A剥取的子房进行消毒处理后，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种在下列胚培养基上MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天，温度为23 27°C条件下，培养20 60天，使白色的胚珠长大变成黑色的种子；C.将步骤B的黑色种子的种皮切开，剥取白色的胚，继续在下列胚培养基中 MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天， 温度为23 27°C条件下，培养20 60天；D.将步骤C所得的成活的胚接种在下列继代培养基上MS+0.05 0. 5mg/L的 ΒΑ+0. 01 0. 3mg/L的NAA，在光照强度为1500 20001x，光照时间为8 12小时/天，温度为22 的条件下，培养20 40天，即得到多倍体香石竹植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A中的四倍体种质为柱头亲合性较强的四倍体种质，且柱头的最佳可授期为柱头弯曲，顶端卷曲，同时柱头上布满绒毛； 所述步骤A中的二倍体种质是与四倍体种质具有互补优良性状且产生2η配子的二倍体种质，2η配子的产生频率为大于或等于0. 01%，人工授粉时选择刚散粉的父本花粉。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤B的消毒处理是用体积浓度为70%的酒精消毒20 60s，再用质量浓度为0. 1 0. 2%的升汞消毒20 60min，无菌水冲洗3 4次。
全文摘要
本发明提供一种多倍体香石竹种质的培育方法，通过产生2n配子的二倍体种质作为父本与四倍体母本杂交，在盛花期，母本去雄并套袋，7～14天后进行人工授粉，授粉15～45天后去袋剥取子房；对子房消毒处理后，切开并剥取白色的胚珠，将胚珠接种在胚培养基上培养，使白色的胚珠长大变成黑色的种子，切开种皮，剥取白色的胚，继续在胚培养基上培养，再在继代培养基上培养，得多倍体香石竹植株。本发明成功将二倍体的有利基因及杂合性导入四倍体栽培种中，并克服胚败育难题，极大地丰富香石竹遗传育种基因库，是目的性状基因渐渗非常有效的途径，有利于不同倍性的种质渗入和基因流动，杂交后代具有更广泛的遗传变异，杂交后代的性状也很稳定。
文档编号A01H4/00GK102217545SQ20111014143
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者周旭红, 张颢, 桂敏, 王慧敏, 王继华, 莫锡君, 陈敏 申请人:云南省农业科学院花卉研究所