专利名称：球花石斛组培工厂化繁育生产方法
技术领域：
本发明涉及一种野生石斛的资源保护与开发利用，特别是涉及球花石斛组培工厂 化繁育生产方法。
背景技术：
石斛是我国用途很广的重要中药材，市场需求量很大，球花石斛是其中的一种。由 于石斛属植物被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》附录I、II类，国家对其采收、经营、 进出口进行严格限制和管理，目前野生石斛越来越无法满足市场需求。国内浙江、安徽、四川、海南、广东等省都在利用当地的资源进行石斛人工种植，但 人工规模化种植所需的种苗问题是制约该产业发展的“瓶颈”。而这些地方主要是铁皮石 斛、霍山石斛、齿瓣石斛等的组织培养研究，对球花石斛涉及较少。自然野生条件下，石斛主要行无性分株繁殖，其繁殖系数低，若干年才能扩大居 群，开始人工种植后，仍需若干年才能分株繁殖。为了加快石斛人工种植产业化的进程，为 了快速获得栽培用石斛种苗，研究球花石斛组培“工厂化”繁育技术具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于解决球花石斛组培工厂化繁育生产方法的技术问题，将球花石 斛通过组织培养出试管苗，然后经炼苗关后，直接移栽大田的有机结合，真正形成规模化种 植的新颖模式的“工厂化”繁育生产方法。本发明采球花石斛组培工厂化繁育生产方法用的技术方案步骤包括有(一)、材料选取及培养(1)、外植体材料选取利用云南野生球花石斛的蒴果，选取石斛的种胚，诱导原球茎，350ml的三角瓶作 为培养容器；O)、培养基及培养条件①改良1/2培养基+萘乙酸0. 5mg/L+马铃薯提取物200g/L，②改良1/2 培养基 +6-苄基腺嘌呤 0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,③改良培养基+6-苄基腺嘌呤 0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,④改良培养基+6-苄基腺嘌呤0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑤改良培养基+6-苄基腺嘌呤0. lmg/L+NAAO. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑥改良培养基+6-苄基腺嘌呤1. 5mg/L+腺嘌呤0. 5mg/L ；(二)、培养方法(1)、培养基制作煮提一配液一测PH值一灌装一灭菌一冷却；O)、培养a.种胚培养，b.原球茎的增殖，
c.丛生苗的分化，d.生根、培壮；(三)、炼苗(1)、蒋培养出的壮苗置于炼苗大棚内，O)、组培苗的出瓶处理，(3)、炼苗基质及处理，0)、栽培和管理。所述步骤(一)中材料选取及培养条件是培养基均加0. 8%琼脂，蔗糖3%、PH 为5. 8，培养室内温度25°C +2°C，光照强度为2000 3000LX，每天光照12小时，培养室每 天需要检查培养情况，淘汰污染苗。所述种胚培养是在超净工作台上，在酒精灯火焰下，将成熟而未开裂的球花石斛 蒴果，使用70 %乙醇及0. 1 %氯化汞进行果实消毒，无菌水冲洗3 4次，浙干，剖开蒴果， 取其种粉状胚接种在①号培养基上，经60天培养，种子80%萌发，40%已生长成堆状的原 球茎； 所述原球茎的增殖是将培养60-75天的原球茎，转接到②号培养基上预培养2 3周，等此转入③号培养基上快速增殖，可叠生于培养基表面2 3cm高；所述丛生苗的分化是将增殖好的原球茎转接到④号培养基上，使刚从原球茎分 化出的小苗迅速成为丛生苗，在无菌条件下，可定期分割转接丛生苗，可不断增加培养瓶
数量；所述生根、培壮是将2 3cm高的小苗转到⑤号培养基上，诱导其根系生长，当有 2 3条幼根时，将生根小苗转到⑥号培养基上，培养出壮苗。所述炼苗大棚用镀锌管做成3. 5m的拱高，铺上塑料薄膜以隔断雨水，在大棚内 2. 5m处做成可浮动的80 90%遮阳网，棚内搭成0. 8m高，1. 5m宽的苗床；边棚在离地面 50cm至an处用防虫网，网外用可卷起的塑料薄膜，用来调节棚内温度和利于通风。所述组培苗的出瓶处理时出苗标准根为4 5条，株高3 5cm以上，茎粗壮，叶 为4 5片。将符合标准的瓶苗取出，不要损伤拉断根系，清水洗净附在根部的培养基。所述炼苗基质及处理是炼苗基质采用刨花，先将刨花用1%。的甲基托布津处理， 含水量40 60%，平铺于苗床上，用塑料薄膜盖住，2 3天后揭开，通气一天，待栽种。所述栽培和管理是将洗好的球花石斛苗按IOcmX IOcm的株行距栽种在苗床上； 栽好后按组培苗炼苗工艺进行肥、水管理；从炼苗圃中选择I、II等优质组培苗进行种植。本发明致力于球花石斛的组织培养、试管苗移栽及大田试验工作，为解决产业化 种植中的所需大量石斛种苗问题，开展石斛人工种植产业化问题，是一种
具体实施例方式下面以实例进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不限于此。外植体一愈伤组织培养一增殖分化一壮苗一生根一适应一炼苗一出圃一移栽。(一)、材料选取及培养(1)、外植体材料选取利用云南野生球花石斛的蒴果，选取石斛的种胚，诱导原球茎，350ml的三角瓶作为培养容器；O)、培养基及培养条件①改良1/2培养基+萘乙酸0. 5mg/L+马铃薯提取物200g/L，②改良1/2 培养基 +6-苄基腺嘌呤 0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,③改良培养基+6-苄基腺嘌呤 0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,④改良培养基+6-苄基腺嘌呤0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑤改良培养基+6-苄基腺嘌呤0. lmg/L+NAAO. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑥改良培养基+6-苄基腺嘌呤1. 5mg/L+腺嘌呤0. 5mg/L ；(二)、培养方法(1)、培养基制作煮提一配液一测PH值一灌装一灭菌一冷却O)、培养a.种胚培养，b.原球茎的增殖，c.丛生苗的分化，d.生根、培壮；(三)、炼苗(1)、蒋培养出的壮苗置于炼苗大棚内，O)、组培苗的出瓶处理，(3)、炼苗基质及处理，0)、栽培和管理。所述步骤(一)中材料选取及培养条件是培养基均加0. 8%琼脂，蔗糖3%、PH 为5. 8，培养室内温度25°C +2°C，光照强度为2000 3000LX，每天光照12小时，培养室每 天需要检查培养情况，淘汰污染苗。所述种胚培养是在超净工作台上，在酒精灯火焰下，将成熟而未开裂的球花石斛 蒴果，使用70 %乙醇及0. 1 %氯化汞进行果实消毒，无菌水冲洗3 4次，浙干，剖开蒴果， 取其种粉状胚接种在①号培养基上，经60天培养，种子80%萌发，40%已生长成堆状的原 球茎；所述原球茎的增殖是将培养60-75天的原球茎，转接到②号培养基上预培养2 3周，等此转入③号培养基上快速增殖，可叠生于培养基表面2 3cm高；所述丛生苗的分化是将增殖好的原球茎转接到④号培养基上，使刚从原球茎分 化出的小苗迅速成为丛生苗，在无菌条件下，可定期分割转接丛生苗，可不断增加培养瓶数 量；所述生根、培壮是将2 3cm高的小苗转到⑤号培养基上，诱导其根系生长，当有 2 3条幼根时，将生根小苗转到⑥号培养基上，培养出壮苗。所述炼苗大棚用镀锌管做成3. 5m的拱高，铺上塑料薄膜以隔断雨水，在大棚内 2. 5m处做成可浮动的80 90%遮阳网，棚内搭成0. 8m高，1. 5m宽的苗床；边棚在离地面 50cm至an处用防虫网，网外用可卷起的塑料薄膜，用来调节棚内温度和利于通风。所述组培苗的出瓶处理时出苗标准根为4 5条，株高3 5cm以上，茎粗壮，叶 为4 5片。将符合标准的瓶苗取出，不要损伤拉断根系，清水洗净附在根部的培养基。
所述炼苗基质及处理是炼苗基质采用刨花，先将刨花用1%。的甲基托布津处理， 含水量40 60%，平铺于苗床上，用塑料薄膜盖住，2 3天后揭开，通气一天，待栽种。所述栽培和管理是将洗好的球花石斛苗按IOcmX IOcm的株行距栽种在苗床上； 栽好后按组培苗炼苗工艺进行肥、水管理；从炼苗圃中选择I、II等优质组培苗进行种植。具体步骤如下一、材料及培养条件1、外植体材料利用云南野生球花石斛(D. thyrsiflorum)的蒴果，选取石斛的种胚，诱导原球 茎，350ml的三角瓶作为培养容器。2、培养基及培养条件①改良1/2MS+NAA0. 5mg/L+ 马铃薯提取物 200g/L，②改良1/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,③改良MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,④改良MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+ 香蕉提取物 20g/L，
⑤改良 MS+6-BA0. lmg/L+NAAO. lmg/L+ 香蕉提取物 20g/L，⑥改良MS+6-BA1. 5mg/L+ 腺嘌呤 0. 5mg/L,上述几个缩写的中文名为MS 培养基；NAA 萘乙酸；BA(6_BA) :6_苄基腺嘌呤。其中MS 是一种培养基；NAA 萘乙酸；BA(6_BA) :6_苄基腺嘌呤；KT 激动素(糖基腺嘌呤)本发明MS培养基可以直接选择市场现有的，也可以自己配制。我在网上找了一份MS培养基配方，不能是否可以，如不要，自己公开一个配 方· ！！本发明MS培养基配方为成分分子量使用浓度(mg/L)硝_■钾 KN03101. 111900硝酉I铵 NH4N0380. 041650大量元素磷酉I 二氢钾 KH2P04136.09250硫酉I镁 MgS04. 7H20246. 47250氯化 丐 CaC12. 2H20147. 02400碘化钾KI166. 010. 83硼酉I H3B0361.835. 72硫酉1,孟 MnS04. 4H20223. 0122. 3微量元素硫酉g锌 ZnS04. 7 H20287. 548.6钼酉I钠 Na2Mo04. 2 H20241. 950. 25硫酉I铜 CuS04. 5 H20249.680. 025氯化钴CoC12. 62237. 930. 025
盐 铁
有机成分二、培养方法1、培养基制作2、培养①种胚培养②原球茎的增殖③丛生苗的分化④生根、培壮三、炼苗1、炼苗大棚2、组培苗的出瓶处理
乙二胺四乙酸二钠Na2. EDTA 372. 25 硫酸亚铁 FeS024. 7H20278. 03
肌醇 甘氨酸
盐酸硫胺素VBl 盐酸吡哆醇VB6 烟酸VB5或VPP
鹿糖 sucrose342. 31
煮提一配液一测PH值一灌装一灭菌一冷却
37. 3 27.8 100 2 0. 1 0. 5 0. 5 30g/L
出苗标准根为4 5条，株高3 5cm以上，茎粗壮，叶为4 5片。将符合标准 的瓶苗取出，不要损伤拉断根系，清水洗净附在根部的培养基。3、炼苗基质及处理4、栽培、管理实施例一、材料及培养条件1、外植体材料采集蒴果的石斛经中国药科大学徐珞珊教授鉴定为球花石斛。石斛的蒴果成熟时 间长，不仅因种类不同而差别很大，一般成熟需要8个月以上。于2002年定株观察，2003年 2月采集蒴果。利用云南野生球花石斛(D. thyrsiflorum)的蒴果，选取石斛的种胚，诱导原 球茎，350ml的三角瓶作为培养容器。2、培养基及培养条件①改良1/2MS+NAA0. 5mg/L+ 马铃薯提取物 200g/L.②改良l/^MS+e-BAO. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L.③改良MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L.④改良MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+ 香蕉提取物 20g/L.⑤改良MS+6-BA0. lmg/L+NAAO. lmg/L+ 香蕉提取物 20g/L.⑥改良MS+6-BA1. 5mg/L+ 腺嘌呤 0. 5mg/L.上述培养基均加0. 8%琼脂，蔗糖3%、pH为5. 8，培养室内温度25 °C +2°C，光照强 度为2000 3000LX，每天光照12小时。培养室需要专职人员管理，每天需要检查培养情 况，淘汰污染苗，注意培养室条件，保持一致。二、培养方法1、培养基制作煮提一配液一测PH值一灌装一灭菌一冷却2、培养①种胚培养在超净工作台上，在酒精灯火焰下，将成熟而未开裂的球花石斛蒴果，使用70%乙 醇(沾一下)及0.1%氯化汞(8 10分种)进行果实消毒，无菌水冲洗3 4次，浙干。 剖开蒴果，取其种胚(粉状)接种在①号培养基上，经60天培养，种子80%萌发，40%已生 长成堆状的原球茎。②原球茎的增殖将培养60-75天的原球茎，转接到②号培养基上预培养2 3周，等此转入③号培 养基上快速增殖，可叠生于培养基表面2 3cm高。③丛生苗的分化将增殖好的原球茎转接到④号培养基上，使刚从原球茎分化出的小苗迅速成为丛 生苗。在无菌条件下，可定期分割转接丛生苗，可不断增加培养瓶数量。④生根、培壮将2 3cm高的小苗转到⑤号培养基上，诱导其根系生长，当有2 3条幼根时， 将生根小苗转到⑥号培养基上，培养出壮苗。三、炼苗
1、炼苗大棚用镀锌管做成3. 5m的拱高，铺上塑料薄膜以隔断雨水，在大棚内2. 5m处做成可浮 动的80 90%遮阳网，棚内搭成0.8m高，1.5m宽的苗床。边棚在离地面50 cm至^ii处用 防虫网，网外用可卷起的塑料薄膜，用来调节棚内温度和利于通风。2、组培苗的出瓶处理出苗标准根为4 5条，株高3 5cm以上，茎粗壮，叶为4 5片。将符合标准 的瓶苗取出，不要损伤拉断根系，清水洗净附在根部的培养基。3、炼苗基质及处理炼苗基质采用刨花，先将刨花用1%。的甲基托布津处理(含水量40 60%)，平铺 于苗床上，用塑料薄膜盖住，2 3天后揭开，通气一天，待栽种。4、栽培、管理将洗好的球花石斛苗按IOcmX IOcm的株行距栽种在苗床上。栽好后按组培苗炼 苗工艺进行肥、水管理，每天需巡视苗床中幼苗生长情况，如发现病虫害或病灶及时用农药 防治。另外，始终保持苗床透气、透水、不积水，让幼苗正常生长。管理中还要不断去劣保优， 使幼苗苗勻，整齐。炼苗一般需8 10个月，培育成可进入大田栽培的种苗。从炼苗圃中选择I、II等优质组培苗进行种植(等级标准如下表)，
权利要求
1.一种球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于步骤包括有(一)、材料选取及培养(1)、外植体材料选取利用云南野生球花石斛的蒴果，选取石斛的种胚，诱导原球茎，350ml的三角瓶作为培 养容器；O)、培养基及培养条件①改良1/2培养基+萘乙酸0.5mg/L+马铃薯提取物200g/L，②改良1/2 培养基 +6-苄基腺嘌呤 0. 3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,③改良培养基+6-苄基腺嘌呤0.3mg/L+NAA0. 05mg/L+KT0. lmg/L,④改良培养基+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+NAA0. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑤改良培养基+6-苄基腺嘌呤0.lmg/L+NAAO. lmg/L+香蕉提取物20g/L，⑥改良培养基+6-苄基腺嘌呤1.5mg/L+腺嘌呤0. 5mg/L ；(二)、培养方法(1)、培养基制作煮提一配液一测PH值一灌装一灭菌一冷却；(2)、培养:a.种胚培养，b.原球茎的增殖，c.丛生苗的分化，d.生根、培壮；(三)、炼苗(1)、蒋培养出的壮苗置于炼苗大棚内，O)、组培苗的出瓶处理，(3)、炼苗基质及处理，G)、栽培和管理。
2.根据权利要求1所述的球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于所述步骤 (一)中材料选取及培养条件是培养基均加0. 8%琼脂，蔗糖3%、PH为5. 8，培养室内温 度25 V +2°C，光照强度为2000 3000LX，每天光照12小时，培养室每天需要检查培养情 况，淘汰污染苗。
3.根据权利要求1或2所述的球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于所述 种胚培养是在超净工作台上，在酒精灯火焰下，将成熟而未开裂的球花石斛蒴果，使用 70%乙醇及0. 1 %氯化汞进行果实消毒，无菌水冲洗3 4次，浙干，剖开蒴果，取其种粉状 胚接种在①号培养基上，经60天培养，种子80%萌发，40%已生长成堆状的原球茎；所述原球茎的增殖是将培养60-75天的原球茎，转接到②号培养基上预培养2 3 周，等此转入③号培养基上快速增殖，可叠生于培养基表面2 3cm高；所述丛生苗的分化是将增殖好的原球茎转接到④号培养基上，使刚从原球茎分化出 的小苗迅速成为丛生苗，在无菌条件下，可定期分割转接丛生苗，可不断增加培养瓶数量；所述生根、培壮是将2 3cm高的小苗转到⑤号培养基上，诱导其根系生长，当有2 3条幼根时，将生根小苗转到⑥号培养基上，培养出壮苗。
4.根据权利要求1或2所述的球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于所述炼苗大棚用镀锌管做成3. 5m的拱高，铺上塑料薄膜以隔断雨水，在大棚内2. 5m处做成可浮 动的80 90 %遮阳网，棚内搭成0. 8m高，1. 5m宽的苗床；边棚在离地面50cm至处用防 虫网，网外用可卷起的塑料薄膜，用来调节棚内温度和利于通风。
5.根据权利要求1或2所述的一种球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于 所述组培苗的出瓶处理时出苗标准根为4 5条，株高3 5cm以上，茎粗壮，叶为4 5 片。将符合标准的瓶苗取出，不要损伤拉断根系，清水洗净附在根部的培养基。
6.根据权利要求1或2所述的球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于所述 炼苗基质及处理是炼苗基质采用刨花，先将刨花用1%。的甲基托布津处理，含水量40 60%，平铺于苗床上，用塑料薄膜盖住，2 3天后揭开，通气一天，待栽种。
7.根据权利要求1或2所述的球花石斛组培工厂化繁育生产方法，其特征在于所述 栽培和管理是将洗好的球花石斛苗按IOcmX IOcm的株行距栽种在苗床上；栽好后按组培 苗炼苗工艺进行肥、水管理；从炼苗圃中选择I、II等优质组培苗进行种植。
全文摘要
本发明公开一种球花石斛组培工厂化繁育生产方法，将球花石斛通过组织培养出试管苗，然后经炼苗关后，直接移栽大田的有机结合，真正形成规模化种植的新颖模式。具体步骤有材料选取及培养条件；培养基制作煮提→配液→测pH值→灌装→灭菌→冷却，培养；炼苗。培养基均加0.8％琼脂，蔗糖3％、pH为5.8，培养室内温度25℃+2℃，光照强度为2000～3000LX，每天光照12小时。培养室每天需要检查培养情况，淘汰污染苗，注意培养室条件，保持一致。本发明在云南省普洱市开展石斛人工种植产业化以来，为解决产业化种植中的所需大量石斛种苗问题，一直致力于球花石斛的组织培养、试管苗移栽及大田的试验工作，取得了较大成功。
文档编号A01G31/00GK102138497SQ201110058288
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月10日 优先权日2011年3月10日
发明者姚德兴, 曾锋, 沈栋侠, 邵德林 申请人:云南金陵植物药业股份有限公司