专利名称：一种洋葱组织培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的培养方法，特别是一种洋葱组织培养方法。
背景技术：
洋葱产业是一个效益显著的产业，目前洋葱已成为了我国最主要的出口创汇蔬菜 之一，许多农民通过洋葱实现了脱贫致富。而为了适应国内外市场需求，洋葱优良品种的需 求也日益增加。由于洋葱传入我国只有百年历史，我国洋葱品种资源少，单是品种引进、常 规品种选育，就要大量进口种子，成本很大；为了加速杂交品种的选育，需要得到洋葱的不 育系和保持系。不管是洋葱优异种质的保存还是杂交育种中不育系和保持系的建立，都可 以采用洋葱组织培养来实现。但是，洋葱品种繁多，不同品种的洋葱对不同成分的培养基， 增殖效果差异很大，直接影响扩繁效果；而且，在培养过程中经常会出现玻璃化及组织材料 老化现象，极大地限制了培养效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以提高洋葱增殖 率，缓解或减少组培苗玻璃化现象及组织材料老化的洋葱组织培养的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种洋葱 组织培养的方法，其特点是，其步骤如下
(1)将收获的新鲜洋葱球置于4-5°C环境中冷藏3-4周；
(2)将冷藏后的洋葱球剥除外皮至直径为2-3cm，然后对它进行消毒处理，消毒后用无 菌水冲洗干净；
(3)在无菌条件下将消毒处理后的洋葱球切除至鳞茎盘为l_2mm厚、贴近鳞茎盘的鳞 茎的长、宽各为4-5mm、高为0. 5-lmm的外植体，再用刀片在鳞茎上表面做“井”字形划痕，然 后将外植体接种到洋葱增殖培养基I或II中；
(4)经过20-30天的培养，获得已长出若干个侧芽的无菌材料；然后按下述方法对无菌 材料进行扩繁将无菌材料置于消毒好的培养皿中，再将侧芽从鳞茎上切下或掰下并转到 洋葱增殖培养基III或IV中培养20-30天，获得已长出丛生芽的无菌材料，其后每20-30 天就可扩繁一次；当扩繁过程中出现玻璃化现象时，则使用增殖培养基V或VI进行培养； 扩繁过程中，含多效唑的增殖培养基不连续使用，含间苯三酚的增殖培养基不连续使用；例 如上一次扩繁使用了增殖培养基III，接下来的扩繁就不使用增殖培养基III，也不使用 增殖培养基IV (因为都含有多效唑)，可以使用一次增殖培养基V或者VI，之间则一般插入 使用增殖培养基I或II 2-4次；
(5)将扩繁得到的洋葱单株壮苗转入生根培养基中进行培养，培养温度为20-25°C， 培养至洋葱生根后，打开培养器皿的封口，再继续培养1-2天后将洋葱苗从培养器皿中取 出，洗净根部附着的培养基，移入装有沙土的盆中，于自然光照条件下，白天22-25°C、夜间 11-15°C的条件下培养20-30天，得成活洋葱苗；所述的洋葱增殖培养基I是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，
花宝 3000-4000; 6-BA (6-苄氨基嘌呤)4-7; NAA (α-萘乙酸)0. 1-0. 6 ；蔗糖30000 ；
琼脂 8000 ；其余为纯净水；ρΗ为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基III除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2-0. 5的多效唑；其ρΗ为5.8 ；
所述的洋葱增殖培养基V除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料外， 还含有重量配比为0. 2-0. 5的间苯三酚；其ρΗ为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基II是由以下重量配比的原料组成单位mg/l， NH4NO31600-1700 ；KNO31800-1900 ；
KH2PO3170-180 ；CaCl2 · 2H20 400-450 ；
MgSO4 · 7H20 350-380 ；FeSO4 · 7H20 26-28 ；
Na2-EDTA35-40 ；MnSO4 · 4H20 20-25 ；
ZnSO4 · 7H207-10 ；H3BO35-7 ；
KI0. 5-1 ；Na2MO4 · 2H20 0. 2-0. 3 ；
CuSO4 · 5H20 0. 02-0. 03 ；CoCl2 · 6H20 0. 02-0. 03 ；
肌醇88-100 ；甘氨酸2-5 ；
盐酸硫胺素 0. 3-0. 5 ；盐酸吡哆素 0. 3-0. 5 ；
烟酸0. 3-0. 5 ；6-BA4-7 ；
NAA0. 1-0.6 ；蔗糖30000 ；
琼脂8000 ；其余为纯净水；ρΗ为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基IV除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2-0. 5的多效唑；其ρΗ为5.8 ；
所述的洋葱增殖培养基VI除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2-0. 5的间苯三酚；其ρΗ为5. 8 ；
洋葱生根培养基是由以下重量配比的原料组成单位mg/l， NH4NO3800-850 ；KNO3900-950 ；
KH2PO385-90 ； CaCl2 · 2H20200-225 ；
MgSO4 · 7H20 175-190 ； FeSO4 · 7H2026-28 ；
Na2-EDTA35-40 ； MnSO4 · 4H2020-25 ；
ZnSO4 · 7H20 7-10 ；H3BO35-7 ；
KI0. 5-1 ；Na2MO4 · 2H200. 2-0. 3 ；
CuSO4 · 5H20 0. 02-0. 03 ； CoCl2 · 6H20 0. 02-0. 03 ； 肌醇88-100 ； 甘氨酸2-5 ；
盐酸硫胺素 0. 3-0. 5 ； 盐酸吡哆素0. 3-0. 5 ；
烟酸0. 3-0. 5 ；IBA1-2 ；
NAA0.01-0.06 ； 蔴糖30000 ；
琼脂8000; 其余为纯净水；ρΗ 5.8。 本发明所述的洋葱组织培养的方法，其特征在于步骤(2)所述的消毒采用下述方法在无菌条件下取洋葱球用75%以上的酒精摇晃浸泡30-60秒，再用质量百分比为 0. 1%的升汞溶液摇晃浸泡10-15分钟。步骤(2)所述的消毒还可以采用组织培养中的可适 用于对洋葱消毒的常规方法。本发明所述的花宝(Hyponex)是指花宝3号，花宝3号的主要成份比例氮、磷、钾 三要素含量分别为10 30 20 ;N，P，K分别指的是NO3硝态氮，PO3氧化磷，KO3氧化钾。 花宝3号是由美国花宝公司生产，原装进口产品，由上海信然生物技术有限公司销售，公司 地址上海市莘浜路35弄1号501室。
—般离体器官培养主要通过愈伤组织形成及芽体诱导形成过程来完成主要的植 株构建，本发明方法利用洋葱的胚细胞形成通过形成胚性细胞来达到植株再生过程，该方 法具有成芽性好植株健壮。在继代生长过程，将间苯三酚作为前体物添加通过代谢过程生 成根皮苷，具有延缓组织老化的倾向和玻璃化的问题，其作用在于对细胞的代谢调节作用 防止植株老化。通过非连续性的添加激素和间苯三酚来达到满足新生组织连续传代，消除激素记 忆效应有利于降低弱苗产生率提高有效成苗率。同时这种途径有利于提高洋葱组培中的诱 导率和一般文献比较，该培养基较文献常用MS培养基具有更好的诱导率和传代性。是一种 新的洋葱组培育种的培养基和培养方法。与现有技术相比，本发明对洋葱品种进行组织培养时，采用区别的培养基，其中利 用花宝的加入来提高其增殖率；在扩繁过程中，使用含适当添加多效唑的培养基，可将增殖 率提高3-5% ；扩繁过程中，使用含适当添加间苯三酚的培养基，可一定程度减少或缓解组 培苗玻璃化现象及组织材料老化。
具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解 本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1。一种洋葱组织培养的方法，其步骤如下
(1)将收获的新鲜洋葱球置于4°c环境中冷藏3周；
(2)将冷藏后的洋葱球剥除外皮至直径为2cm，然后对它进行消毒处理，消毒后用无菌 水冲洗干净；
(3)在无菌条件下将消毒处理后的洋葱球切除至鳞茎盘为Imm厚、贴近鳞茎盘的鳞茎 的长、宽各为4mm、高为0. 5mm的外植体，再用刀片在鳞茎上表面做“井”字形划痕，然后将外 植体接种到洋葱增殖培养基I或II中；
(4)经过20-30天的培养，获得已长出若干个侧芽的无菌材料；然后按下述方法对无菌 材料进行扩繁将无菌材料置于消毒好的培养皿中，再将侧芽从鳞茎上切下或掰下并转到 洋葱增殖培养基III或IV中培养20-30天，获得已长出丛生芽的无菌材料，其后每20-30 天就可扩繁一次；当扩繁过程中出现玻璃化现象时，则使用增殖培养基V或VI进行培养； 扩繁过程中，含多效唑的增殖培养基不连续使用，含间苯三酚的增殖培养基不连续使用；
(5)将扩繁得到的洋葱单株壮苗转入生根培养基中进行培养，培养温度为20°C，培养至 洋葱生根后，打开培养器皿的封口，再继续培养1-2天后将洋葱苗从培养器皿中取出，洗净 根部附着的培养基，移入装有沙土的盆中，于自然光照条件下，白天22°C、夜间IPC的条件下培养20-30天，得成活洋葱苗；
所述的洋葱增殖培养基I是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，
花宝 3000 ；6-BA4 ；
NAA 0. 1 ；蔗糖30000 ；
琼脂 8000 ；其余为纯净水；pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基III除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2的多效唑；其pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基V除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料外， 还含有重量配比为0. 2的间苯三酚；其pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基II是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，
NH4NO31600 ；KNO31800 ；
KH2PO3170 ；CaCl2 · 2H20 400 ；
MgSO4 · 7H20 350 ；FeSO4 · 7H20 26 ；
Na2-EDTA35 ；MnSO4 · 4H20 20 ；
ZnSO4 · 7H20 7 ；H3BO35 ；
KI0. 5 ；Na2MO4 · 2H20 0. 2 ；
CuSO4 · 5H20 0. 02 ；CoCl2 · 6H20 0. 02 ；
肌醇88 ；甘氨酸2 ；
盐酸硫胺素 0.3;盐酸吡哆素 0.3;
烟酸0. 3 ；6-BA4 ；
NAA0. 1 ；蔗糖30000 ；
琼脂8000 ；其余为纯净水；pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基IV除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2的多效唑；其pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基VI除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 2的间苯三酚；其pH为5. 8 ；
洋葱生根培养基是由以下重量配比的原料组成单位mg/l， NH4NO3800 ；KNO3900 ；
KH2PO385 ； CaCl2 · 2H20200 ；
MgSO4 · 7H20 175 ； FeSO4 · 7H2026 ；
Na2-EDTA35 ； MnSO4 · 4H20 20 ；
ZnSO4 · 7H20 7 ；H3BO35 ；
KI0. 5 ； Na2MO4 · 2H20 0. 2 ；
CuSO4 · 5H20 0. 02 ； CoCl2 · 6H20 0. 02 ； 肌醇88 ； 甘氨酸2 ；
盐酸硫胺素 0.3; 盐酸吡哆素0.3;
烟酸0. 3 ；IBA1 ；
NAA0.01 ； 蔗糖30000 ；
琼脂8000; 其余为纯净水；pH 5.8。
实施例2。一种洋葱组织培养的方法，其步骤如下
(1)将收获的新鲜洋葱球置于5°C环境中冷藏4周；
(2)将冷藏后的洋葱球剥除外皮至直径为2-3cm，然后在无菌条件下取洋葱球用75%以 上的酒精摇晃浸泡30-60秒，再用质量百分比为0. 1%的升汞溶液摇晃浸泡10-15分钟，对 它进行消毒处理，消毒后用无菌水冲洗干净；
(3)在无菌条件下将消毒处理后的洋葱球切除至鳞茎盘为2mm厚、贴近鳞茎盘的鳞茎 的长、宽各为5mm、高为Imm的外植体，再用刀片在鳞茎上表面做“井”字形划痕，然后将外植 体接种到洋葱增殖培养基I或II中；
(4)经过20-30天的培养，获得已长出若干个侧芽的无菌材料；然后按下述方法对无菌 材料进行扩繁将无菌材料置于消毒好的培养皿中，再将侧芽从鳞茎上切下或掰下并转到 洋葱增殖培养基III或IV中培养20-30天，获得已长出丛生芽的无菌材料，其后每20-30 天就可扩繁一次；当扩繁过程中出现玻璃化现象时，则使用增殖培养基V或VI进行培养； 扩繁过程中，含多效唑的增殖培养基不连续使用，含间苯三酚的增殖培养基不连续使用；
(5)将扩繁得到的洋葱单株壮苗转入生根培养基中进行培养，培养温度为20-25°C，培 养至洋葱生根后，打开培养器皿的封口，再继续培养1-2天后将洋葱苗从培养器皿中取出， 洗净根部附着的培养基，移入装有沙土的盆中，于自然光照条件下，白天25°C、夜间15°C的 条件下培养20-30天，得成活洋葱苗；
所述的洋葱增殖培养基I是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，
花宝 4000 ；6-BA7 ；
NAA 0. 6 ；蔗糖30000 ；
琼脂 8000 ；其余为纯净水；pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基III除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料 夕卜，还含有重量配比为0. 5的多效唑；其pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基V除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料外， 还含有重量配比为0. 5的间苯三酚；其pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基II是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，
NH4NO31700 ；KNO31900 ；
KH2PO3180 ；CaCl2 · 2H20 450 ；
MgSO4 · 7H20 380 ；FeSO4 · 7H20 28 ；
Na2-EDTA40 ；MnSO4 · 4H20 25 ；
ZnSO4 · 7H20 10 ；H3BO37 ；
KI1 ；Na2MO4 · 2H20 0. 3 ；
CuSO4 · 5H20 0. 03 ；CoCl2 · 6H20 0. 03 ；
肌醇100 ；甘氨酸 5 ；
盐酸硫胺素 0.5;盐酸吡哆素 0.5;
烟酸0. 5 ；6-BA7 ；
NAA0.6 ；蔗糖30000 ；
琼脂 8000 ；其余为纯净水；pH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基 IV除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0. 5的多效唑；其PH为5. 8 ；
所述的洋葱增殖培养基VI除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0. 5的间苯三酚；其pH为5. 8 ；
洋葱生根培养基是由以下重量配比的原料组成单位mg/l， NH4NO3850 ；KNO3950 ；
KH2PO390 ； CaCl2 · 2H20 225 ；
MgSO4 · 7H20 190 ； FeSO4 · 7H20 28 ； Na2-EDTA40 ； MnSO4 · 4H20 25 ；
ZnSO4 · 7H20 10 ； H3BO37 ；
KI1 ； Na2MO4 · 2H200. 3 ；
CuSO4 · 5H20 0. 03 ； CoCl2 · 6H20 0. 03 ； 肌醇100 ； 甘氨酸5 ；
盐酸硫胺素 0.5; 盐酸吡哆素0.5;
烟酸0. 5 ；IBA2 ；
NAA0.06 ； 蔗糖30000 ；
琼脂8000; 其余为纯净水；pH 5.8。
权利要求
一种洋葱组织培养的方法，其特征在于，其步骤如下(1)将收获的新鲜洋葱球置于4 5℃环境中冷藏3 4周；(2)将冷藏后的洋葱球剥除外皮至直径为2 3cm，然后对它进行消毒处理，消毒后用无菌水冲洗干净；(3)在无菌条件下将消毒处理后的洋葱球切除至鳞茎盘为1 2mm厚、贴近鳞茎盘的鳞茎的长、宽各为4 5mm、高为0.5 1mm的外植体，再用刀片在鳞茎上表面做“井”字形划痕，然后将外植体接种到洋葱增殖培养基I或II中；(4)经过20 30天的培养，获得已长出若干个侧芽的无菌材料；然后按下述方法对无菌材料进行扩繁将无菌材料置于消毒好的培养皿中，再将侧芽从鳞茎上切下或掰下并转到洋葱增殖培养基III或IV中培养20 30天，获得已长出丛生芽的无菌材料，其后每20 30天就可扩繁一次；当扩繁过程中出现玻璃化现象时，则使用增殖培养基V或VI进行培养；扩繁过程中，含多效唑的增殖培养基不连续使用，含间苯三酚的增殖培养基不连续使用；(5)将扩繁得到的洋葱单株壮苗转入生根培养基中进行培养，培养温度为20 25℃，培养至洋葱生根后，打开培养器皿的封口，再继续培养1 2天后将洋葱苗从培养器皿中取出，洗净根部附着的培养基，移入装有沙土的盆中，于自然光照条件下，白天22 25℃、夜间11 15℃的条件下培养20 30天，得成活洋葱苗；所述的洋葱增殖培养基I是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，花宝3000 4000； 6 BA 4 7；NAA0.1 0.6； 蔗糖30000；琼脂 8000；其余为纯净水；pH为5.8；所述的洋葱增殖培养基III除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0.2 0.5的多效唑；其pH为5.8；所述的洋葱增殖培养基V除含有洋葱增殖培养基I中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0.2 0.5的间苯三酚；其pH为5.8；所述的洋葱增殖培养基II是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，NH4NO3 1600 1700； KNO3 1800 1900；KH2PO3 170 180；CaCl2·2H2O400 450；MgSO4·7H2O 350 380； FeSO4·7H2O 26 28；Na2 EDTA 35 40；MnSO4·4H2O 20 25；ZnSO4·7H2O7 10； H3BO3 5 7；KI0.5 1； Na2MO4·2H2O0.2 0.3；CuSO4·5H2O 0.02 0.03；CoCl2·6H2O0.02 0.03；肌醇 88 100；甘氨酸 2 5；盐酸硫胺素 0.3 0.5； 盐酸吡哆素 0.3 0.5；烟酸 0.3 0.5；6 BA 4 7；NAA0.1 0.6； 蔗糖30000；琼脂8000； 其余为纯净水； pH为 5.8；所述的洋葱增殖培养基IV除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0.2 0.5的多效唑；其pH为5.8；所述的洋葱增殖培养基VI除含有洋葱增殖培养基II中所述的重量配比的全部原料外，还含有重量配比为0.2 0.5的间苯三酚；其pH为5.8；洋葱生根培养基是由以下重量配比的原料组成单位mg/l，NH4NO3 800 850； KNO3 900 950；KH2PO3 85 90； CaCl2·2H2O 200 225；MgSO4·7H2O 175 190；FeSO4·7H2O 26 28；Na2 EDTA35 40； MnSO4·4H2O 20 25；ZnSO4·7H2O 7 10； H3BO3 5 7；KI0.5 1；Na2MO4·2H2O 0.2 0.3；CuSO4·5H2O 0.02 0.03； CoCl2·6H2O 0.02 0.03；肌醇88 100； 甘氨酸 2 5；盐酸硫胺素 0.3 0.5；盐酸吡哆素 0.3 0.5；烟酸0.3 0.5； IBA 1 2；NAA 0.01 0.06；蔗糖 30000；琼脂 8000； 其余为纯净水； pH 5.8。
2.根据权利要求1所述的洋葱组织培养的方法，其特征在于步骤(2)所述的消毒采用 下述方法在无菌条件下取洋葱球用75%以上的酒精摇晃浸泡30-60秒，再用质量百分比为 0. 1%的升汞溶液摇晃浸泡10-15分钟。
全文摘要
本发明是一种洋葱组织培养的方法，其特征在于将收获的新鲜洋葱球冷藏，然后剥除外皮至直径为2-3cm，然后对它进行消毒处理；然后在无菌条件下将消毒处理后的洋葱球切除成外植体，然后将外植体接种到洋葱增殖培养基I或II中；经过培养，获得已长出若干个侧芽的无菌材料；其后每20-30天就可扩繁一次；将扩繁得到的洋葱单株壮苗转入生根培养基中进行培养，得成活洋葱苗；本发明对洋葱品种进行组织培养时，采用区别的培养基，其中利用花宝的加入来提高其增殖率；在扩繁过程中，使用含适当添加多效唑的培养基，可将增殖率提高3-5%，使用含适当添加间苯三酚的培养基，可一定程度减少或缓解组培苗玻璃化现象及组织材料老化。
文档编号A01H4/00GK101986830SQ20101056767
公开日2011年3月23日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者乔延军, 周翔, 孙桂乐, 杨海峰, 潘美红, 缪美华, 薛萍, 陈振泰 申请人:连云港市农业科学院