专利名称：水稻OsPSK3基因在改良水稻农艺性状方面的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种改良水稻农艺性状方法。
背景技术：
水稻是我国主要的粮食作物，13亿人口有60%以大米为食。随着我国人口的增长， 对水稻的需求亦与日俱增。所以提高水稻产量具有重要的意义。水稻的生长过程分为营养 生长与生殖生长两部分，优异的营养性状是保证水稻稳产、高产的重要前提。目前国内外利用转基因改良农作物经济性状的技术主要是根据已知的功能基因 与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植 物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。植物磺肽激素(Phytosulfokine，PSK-α )是新发现的一种具有促进细胞分裂 和分化的植物激素。由Matsubayashi等[1]第一次从石刁柏(Asparagus officinalis Linn)叶肉细胞中分离得到。此后，研究人员又从玉米、胡萝卜、水稻、鱼尾菊、日本柳杉 和拟南芥等物种的条件培养基中陆续鉴定到了 PSK-α [2~9]，说明PSK在植物中广泛存在。 Matsubayashi等_发现了植物磺肽激素、生长素和细胞分裂素三者缺一不可、共同作用促 进细胞增殖；并且PSK的产生需受到生长素和细胞分裂素的共同调节。现有的研究发现PSK 还具有如下功能促进导管分化和胚性细胞形成[9]；促进植物器官形成和生长[2’ 6_8’ "_12]； 在培养基中添加PSK-α情况下，可以调节花粉的群体效应[13]，提高黄化的子叶中叶绿素含 量[14]，并能通过维持幼苗鲜重和叶绿素含量提高植物对热胁迫的抗性[15]。目前PSK主要 应用于组培中，作为外激素来促进低浓度悬浮细胞的增殖。
发明内容
本发明的目的为提出水稻fls/^f基因在改良水稻生长势和光合作用等农艺性状 方面的应用。本发明利用水稻0sPSK3编码顺序构建组成型或组织特异型表达载体转化水稻 (包括籼稻与粳稻)，培育生长势增强，植株粗壮，株型优良，叶绿素含量高的水稻转基因品 系。本发明还包括水稻fls/^rj基因的分离、克隆与转基因功能研究等。1)植物磺肽激素基因0sPSK3表达载体的构建
采用PCAMBIA1304为表达载体，将0sPSK3基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启 动子下游BWII和S/^l。表达载体结构见图1。水稻植物磺肽激素蛋白前体基因《s/^TJ 的全长 cDNA(AK062614),见 SEQ. ID. NO. 1。2)植物磺肽激素蛋白前体基因0sPSK3转化水稻实验与结果
利用籼稻9311为转基因受体。将水稻种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培养基 上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含基因的 纯化的重组质粒导入籼稻9311愈伤组织细胞。在添加30mg/L潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。抗 性小苗经PCR验证，最终得到4株转0sPSK3基因阳性苗(图2)。 3)半定量PCR和荧光定量PCR (real-time PCR)分析内源0sPSK3在对照9311和 转0sPSK3基因植株中的表达量
用半定量PCR检测发苗14天的转基因Tl代中基因在根、茎、叶器官中的表达 情况。以籼稻9311为对照，用β -actin作为内参(图3)。我们发现0sPSK3在对照各器官 中的表达量很低；转基因系中在茎部位《s/^rj基因表达较强。 通过调整PCR体系和增加循环数，利用Real-time PCR检测植物茎中0sPSK3基因 的表达量。数据显示(图在转基因植株中的表达量相比对照9311提高了约40%， 这同样表明《s/^rj基因片段的引入确实引起了 fls/^rj基因的表达量增多。4)转植物磺肽激素蛋白前体基因0sPSK3水稻表现出优于对照的营养性状 fls/^rj转基因水稻T1代表现出优于对照9311的农艺性状转fls/^rj基因水稻种子萌
发速度明显快于对照，露白后继续培养14天可见转fls/^rj基因水稻幼苗相比对照生长出 更多不定根，系根上分化出更多的根毛，须根系较对照更为发达。统计结果显示转基因品系 平均有5. 1个不定根，而对照9311平均有3. 0个不定根。转基因植株的茎明显长于对照， 且该生长优势能一直保持至结穗期，成熟的转《s/^rj基因植株茎杆更粗壮(图5)。5)转植物磺肽激素蛋白前体基因0sPSK3水稻中叶绿素含量显著提高
转基因水稻在三叶期时就表现出叶片颜色比对照明显加深，颜色深绿(图6)。新鲜叶片 叶绿素含量测定结果显示，转基因植株叶片中叶绿素含量为2. 097士0. 449 mg/g，对照9311 中为0. 893士0. 137 mg/g，转0sPSK3基因系植株的叶绿素含量为对照9311的2. 3倍，表明 基因的过表达提高了植株叶绿素的含量，提高了植株叶绿素形成的能力(图7)。本发明中，用于转化水稻的0sPSK3基因序列及翻译的蛋白，使用的PCR扩增引物 为(SEQ. ID. NO. 2)
osPSK3-2-ls (5， -AAACAGATCTCGCCATGTCACCGAAG-3，) osPSK3-2-la (5， -TGACTAGTATTGTGTTTGCCCTGCGTGT-3，) 使用的序列为(SEQ. ID. NO. 3)
atgtcaccgaaggtcatagccatttgccttgtagcacttctcctt MSPKVIAICLVALLL cccatcagcataagccatggtggtagaattgggccaattgaaccc PISI SHGGRIGPIEP agcaaagcttccagtaaggttgtggagaggggaaactacgatggt SKASSKVVERGNYDG agagtggaaggttgcgaagaagatgattgcctagtggagcgtttg RVEGCEEDDCLVERL ctcgtggctcatctggactacatctacacgcagggcaaacacaat LVAHLDYIYTQGKHN actagt
利用与《s/^rj基因连锁的下游GusA基因设计的引物GUSl进行阳性检测，引物序列为 (SEQ. ID. NO. 4)
4GUSls 5，-TCGGCTTTCAGCTGTCTTTAGG-3， GUSla 5' -GTCGGTGTACATTGAGTGCAGC-3' 扩增片段长度494bp。
图l、0sPSK3-pCAMIBIA1304植物表达载体构建示意图。图 2、0sPSK3-pCAMIBIA 1304 转基因水稻 TO 代水稻 PCR 检测，M :DL 2000 DNA Ladder ；+ 质粒阳性对照；-阴性对照；Γ4 :0sPSK3-pCAMIBIA 1304转基因阳性植株； 5 12 :0sPSK3-pCAMIBIA 1304转基因阴性植株。图3、转0sPSK3基因水稻与对照9311中0sPSK3在根、茎、叶中的表达，Control 为对照9311。图4、转0sPSK3基因水稻与对照9311在茎中0sPSK3表达量情况。图5、幼苗期与结穗期0sPSK3ox_l植株与对照9311表型，a、b: 0sPSK3ox_l与 对照14 d幼苗植株；c:14 d对照幼苗根部；d:14 d 0sPSK3oX-l幼苗根部；e、f 0sPSK3ox-l植株与对照结穗期植株(左为对照9311)。图6、三叶期0sPSK3ox_l植株与对照幼苗。图7、对照与0sPSK3oX-l叶片叶绿素含量比较。
具体实施例方式1)表达载体 pCAMBIA1304 - 0sPSK3 构建
用带酶切位点的引物克隆水稻植物磺肽激素蛋白前体基因0sPSK3，将0sPSK3 基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游BWII和SpeI。表达载体 pCAMBIA1304-0sPSK3 构建完成。2)诱导水稻愈上组织培养基
诱导及继代培养基MS + 2 mg/L 2，4-D。高渗培养基MS+ 2 mg/L 2，4_D + 46.67 g/L 山梨醇 + 46.67 g/L 甘露醇。轮筛选培养基MS+ 2 mg/L 2，4_D + 30 mg/L 潮霉素。分化培养基:MS+ 3 mg/L 6-BA + 0. 5 mg/L NAA + 30mg/L 潮霉素。生根壮苗培养基1/2MS + 0. 1 mg/L NAA。注以上培养基均含30g/L蔗糖+ 2.5 g/L agar, pH 5.8。愈伤诱导、继代、筛 选培养条件为26-28°C暗培养，分化、生根壮苗为26-28°C及16小时光周期。3)愈伤组织诱导与处理
取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70%乙醇浸洗10 min，转入0. 1% 升汞浸泡20 min，无菌水清洗3次。在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上， 26-28°C暗培养约20天后切芽，继代一次。在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤 约30-50块(每块3 mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2. 5 cm的圆圈内，培养 约4-5 h后用于转化。4)基因枪转化
基因枪从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪，型号GJ-1000。
微粒子弹制备称取60mg钨粉(直径约1 um)，加入到1. 5 ml灭菌离心管中，再加 入Iml无水乙醇，振荡1 min，于10000 rpm离心10 s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮 于1 ml无菌水中现用或-20°C保存。吸取50 ul钨粉悬浮液于1.5 ml离心管，依次加入5 ug DNA, 50 ul 2. 5 M CaCl2, 20 ul 0.1 M亚精胺，振荡5分钟，10000 rpm离心20 s，弃上清，以140 ul无水乙醇漂洗两 次，加入60 ul无水乙醇，悬浮待用。5)轰击受体材料
将基因枪放于超净工作台上，用70%酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网 (均由宁波新芝科技有限公司供货)于70%酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹 净残余酒精。打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀。将可裂膜装入固定、旋紧。取10 ul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均勻涂布于载粒膜中心，放在超净台上 吹干。将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下。将培养皿放 在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央。打开气瓶，调节压力1100 Psi。抽真空，当真空度达 到需要值时，将VAC键转到Hold位置。轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90 度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品。轰击后于高渗培养基上继续培养12-16 h。6)转化愈伤组织筛选
将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天。将愈 伤转到含30 mg/L潮霉素的筛选培养基上，均勻摆放，暗培养7-14天进行抗性筛选，然后 再筛选10天。7)水稻fls^SK 基因转化植株的筛选与检测
将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天。待分化出小植株后，将小植株转 入生根壮苗培养基，长大后移入温室。分别采用PCR扩增法检测候选的抗性植株。参考文献Matsubayashi Y, Sakagami Y. Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc Natl Acad Sci USA, 1996，93(15): 7623 - 7627.Stuart R, Street HE. Studies on the growth in culture of plant cells: IV. The initiation of division in suspensions of stationary-phase cells of Acer Pseudoplatanus L. J. Exp. Bot. , 1969, 20(3): 556 - 571.Yang HP, Matsubayashi Y, Nakamura K, Sakagami Y. Diversity of Arabidopsis genes encoding precursors for phytosulfokine, a peptide growth factor. Plant Physiol, 2001，127(3) : 842 - 851.Yang HP, Matsubayashi Y, Nakamura K, Sakagami Y. Oryza sativa PSK gene encodes a precursor of phytosulfokine-α , a sulfated peptide growth factor found in plants. Proc Natl Acad Sci USA, 1999，96(23): 13560 - 13565.Lorbiecke R, Sauter M. Comparative analysis of PSK peptide growth factor precursor homologs. Plant Sci, 2002, 163(2): 321 - 332.Yang G, Shen S, Kobayashi T, Matsubayashi Y, Sakagami Y, Kamada H.Stimulatory effects of a novel peptidyl plant growth factor, phytosulfokine-. alpha.，on the adventitious bud formation from callus of Antirrhinum majs. Plant Biotechnol Jj 1999，16(3) : 231 - 234.Igasaki T， Akashi N， Ujino-Ihara T， Matsubayashi Y， Sakagami Y， Shinohara K. Phytosulfokine stimulates somatic embryogenesis in Cryptomeria japonica. Plant Cell Physiol, 2003，44(12) : 1412 - 1416.Hanai H， Matsuno T， Yamamoto M， Matsubayashi Y， Kobayashi T， Kamada H， Sakagami Y. A secreted peptide growth factor, phytosulfokine, acting as a stimulatory factor of carrot somatic embryo formation. Plant Cell Physiol, 2000，41 (1) : 27 - 32.Matsubayashi Y， Takagi Y， Omura N， Morita A， Sakagami Y. The endogenous sulfated pentapeptide phytosulfokine-alpha stimulates tracheary element differentiation of isolated mesophyll cells of Zinnia. Plant Physiol, 1999， 120(4) : 1043 - 1048.MatsubayashiY， Morita A， Matsunaga E， Furuya A， Hanai N， Sakagami Y. Physiological relationships between auxin, cytokinin, and a peptide growth factor, phytosulfokine-α， in stimulation of asparagus cell proliferation. Plantaj 1999，207(4): 559 - 565.Kutschmar A， Rzewuski G， Stuhrwohldt N， Beemster GTSj Inze D， Sauter M. PSK-a promotes root growth in Arabidopsis. New Phytolj 2009, 181(4): 820 - 831.AmanoY， Tsubouchi H， Shinohara H， Ogawa M， Matsubayashi Y. Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(46): 18333 - 18338.Chen YFj Matsubayashi Y， Sakagami Y. Peptide growth factor phytosulfokine-α contributes to the pollen population effect. Plantaj 2000, 211 (5) : 752 - 755.Yamakawa S， Matsubayashi Y， Sakagami Y， Kamada H， Satoh S. Promotion by a peptidyl growth factor, phytosulfokine, of chlorophyll formation in etiolated cotyledon of cucumber. Biosci Biotech Biochj 1998, 62(12): 2441 - 2443.YamakawaS， Matsubayashi Y， Sakagami Y， Kamada H， Satoh S. Promotive effects of the peptidyl plant growth factor, phytosulfokine-alpha, on the growth and chlorophyll content of Arabidopsis seedlings under high night-time temperature conditions. Biosci Biotech Biochj 1999，63(12): 2240 - 2243。
权利要求
1.水稻0sPSK3基因在改良水稻农艺性状方面的应用，其特征在于利用水稻0sPSK3基 因转化籼稻，以提高水稻作物的生长势、光合作用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于采用籼稻9311为转基因受体，构建0sPSK3 基因的过表达转基因植株。
3.一种0sPSK3基因过表达载体，其特征在于采用pCAMBIA1304为表达载体，将籼稻 9311的AsASf基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游而获得。
全文摘要
本发明属于转基因技术领域，具体为水稻OsPSK3基因在改良水稻农艺性状方面的应用。在籼稻中过表达该基因时，转基因植株表现出更强的生长势，包括植株萌发和生长更加迅速，须根系较对照更为发达，叶片颜色明显加深，茎杆变长，成熟时茎杆粗壮，叶片颜色墨绿，这一系列农艺表型的变化，会增强植株的生长势，叶片中叶绿素含量从苗期就明显增加的表型会增强品种的光合作用。根据本发明，可利用基因工程方法培育转OsPSK3基因水稻，提高水稻作物的生长势、光合作用等农艺性状。
文档编号A01H5/00GK102002506SQ20101051570
公开日2011年4月6日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者杨金水, 王玉锋, 黄霁月 申请人:复旦大学